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1、1,第八章,吸 光 光 度 法,2,化学分析：常量组分(1%),Er 0.1%0.2%依据化学反应,使用玻璃仪器,化学分析与仪器分析方法比较,仪器分析：微量组分(1%),Er 1%5%依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器,例:含Fe约0.05%的样品,称0.2g,则m(Fe)0.1mg,重量法 m(Fe2O3)0.14mg,称不准,容量法 V(K2Cr2O7)0.02mL,测不准,光度法 结果0.048%0.052%,满足要求,准确度高,灵敏度高,3,8.1 吸光光度法的基本原理,特点 灵敏度高：测定下限可达105106mol/L,10-4%10-5%准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误
2、差25（12）操作简便快速应用广泛,吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。,4,1.光的基本性质 电磁波的波粒二象性,c真空中光速 2.99792458108m/s3.0 108m/s波长，单位：m,cm,mm,m,nm,1m=10-6m,1nm=10-9m,1=10-10m频率，单位：赫芝（周）Hz 次/秒 n折射率，真空中为1,光的传播速度:,波动性,5,磁场向量,电场向量,传播方向,Y,Z,X,与物质作用,6,微粒性,h普朗克(Planck)常数 6.62610-34Js频率E光量子具有的能量 单位：J(焦耳)，eV(电子伏特),光量子，具有能量。,
3、7,波粒二象性,结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越 长(频率越低)，光量子的能量越低。单色光：具有相同能量(相同波长)的光。混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在 一起。,真空中:,8,光学光谱区,10nm200nm,200nm 380nm,380nm 780nm,780 nm 2.5 m,2.5 m 50 m,50 m 300 m,9,3.溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱,不同颜色的可见光波长及其互补光,10,300,400,500,600,700,/nm,350,525 545,Cr2O72-,MnO4-,Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱,350,11,苯和甲苯在环己烷中的
4、吸收光谱,12,4.光吸收基本定律:Lambert-Beer定律,A=lg(I0/It)=kbc,朗伯定律(1760)A=lg(I0/It)=k1b,比尔定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c,13,T透光率（透射比）（Transmittance）,A=lg(I0/It)=lg(1/T)=-lgT=kbc,14,吸光度A、透射比T与浓度c的关系,15,K 吸光系数 Absorptivity,当c的单位用g100mL-1表示时，用 表示，A bc，叫做比消光系数,16,吸光度与光程的关系 A=bc,17,吸光度与浓度的关系 A=bc,18,朗伯-比尔定律的适用条件,1.单色光 应选用ma
5、x处或肩峰处测定2.吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系 应控制条件(酸度、浓度、介质等)3.稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强,19,亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱a.6.3610-6 mol/Lb.1.2710-4 mol/Lc.5.9710-4 mol/L,亚甲蓝阳离子单体 max=660 nm二聚体 max=610 nm,二聚体的生成破坏了A与c的线性关系,20,溶液浓度的测定,A bc,工作曲线法(校准曲线),朗伯-比尔定律的分析应用,21,6.吸光度的加和性与吸光度的测量,A=A1+A2+An,用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的
6、吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。,22,8.2 光度分析的方法和仪器8.2.1 光度分析的几种方法,方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。,1.目视比色法,23,2.光电比色法,通过滤光片得一窄范围的光(几十nm),24,3.吸光光度法和分光光度计,通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调,故选择性好,准确度高.,25,722型分光光度计结构方框图,光源,吸收池,检测系统,分光系统,26,分光光度计的主要部件,光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度,稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯(3202500nm)紫外区：氢灯，氘灯(180375nm)单色器：将光源发出的连续光谱分解为单
7、色光的 装置。棱镜:玻璃3503200nm,石英1854000nm 光栅:波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便,27,吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池检测器：利用光电效应，将光能转换成 电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管指示器：低档仪器：刻度显示 中高档仪器：数字显示，自动扫描记录,28,棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,单色器,29,光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。,原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.,30,检测器,硒光电池,Ag、Au,31,光电管,红敏管
8、625-1000 nm蓝敏管 200-625 nm,32,光电倍增管,待扫描,160-700 nm,1个光电子可产生106107个电子,33,8.2.2 分光光度计的类型,34,多通道仪器（Multichannel Instruments）,光电二极管阵列(通常具有316个硅二极管)photodiode arrays(PDAs)同时测量200820nm范围内的整个光谱,比单个检测器快316倍,信噪比增加 316 1/2 倍.,其他类型分光光度计,将光度计放入样品中,原位测量.对环境和过程监测非常重要.,纤维光度计,35,镀铝反射镜,纤维光度计示意图,36,8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度,一
9、.灵敏度的表示方法:摩尔吸光系数(),A=b c=A/bc(Lmol-1cm-1),越大,灵敏度越高:1045104 为中等灵敏度;105为高灵敏度;104为低灵敏度.,37,例1 邻二氮菲光度法测铁(Fe)=1.0mg/L,b=2cm,A=0.38 计算 和,解：c(Fe)=1.0 mg/L=1.010-3/55.85=1.810-5mol/L,38,c=1.0mg/L=1.010-3 g/1000mL=1.010-4g/100mL,39,二.准确度仪器测量误差,光度计的读数误差一般为0.22(T),由于T与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的T引起的误差不同。,40,浓度测量的相对误差与T(
10、或A)的关系,实际工作中，应控制T在1070,A在0.151.0之间(调c,b,),41,8.4 显色反应与分析条件的选择,8.4.1 显色剂与显色反应,无机显色剂:SCN-Fe(SCN)2+H2O2 TiOH2O22+,有机显色剂:,42,有机显色剂,OO型：,ON型：,PAR,S型：,双硫腙,NN型：,丁二酮肟,邻二氮菲,磺基水杨酸,43,显色反应的选择,*灵敏度高，一般104*选择性好*显色剂在测定波长处无明显吸收。对照性好,max60 nm.*反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，重现性好。,44,8.4.2 显色条件的确定,c(R),c(R),c(R),1.显色剂用
11、量（c(M)、pH一定）,Mo(SCN)32+浅红Mo(SCN)5 橙红Mo(SCN)6-浅红,Fe(SCN)n3-n,45,2.显色反应酸度（c(M)、c(R)一定）,pH1pHpH2,pH,46,邻二氮菲亚铁反应完全度与pH的关系,Fe2+3R,c(R)R=10-4molL-1,31021.3,47,pH38为适宜的酸度范围,48,3.显色温度及显色时间,另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等,T1(),T2(),t(min),A,49,8.4.3 干扰及消除,测Co2(含Fe3+):(掩蔽法),1.化学法,50,测Co2:(生成络合物性质不同),如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰
12、，则需采取分离法。,测Fe3:(控制pH),51,2.物理法,选择适当的测定波长,52,1.仅络合物有吸收，溶剂作参比。如 phenFe2+标准曲线2.待测液也有吸收，被测液作参比。如 测汽水中的 Fe3.显色剂或其他试剂也有吸收，空白溶液作参比 例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的 Fe，参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。4.干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：1）掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比.2）加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.,-选择适当的参比溶液,53,8.5 吸光光度法的应用,1.单一组分测定,1)金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂,2)
13、磷的测定:DNA中含P9.2%,RNA中含P9.5%,可得核酸量.,H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O,磷钼黄(小),磷钼(V)蓝(大),54,3)蛋白质测定溴甲酚绿、考马司亮蓝等4)氨基酸测定茚三酮(紫色化合物)5)水质检测:NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+-6)药物含量测定比吸光系数定量；荷移光谱法测定.7)紫外吸收(UV):NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。,55,2.多组分的测定,xl1,eyl1,exl2,eyl
14、2由x,y标液 在1,2处分别测得,在1处测组分x,在2处测组分y,b)在1处测组分x;在2处测总吸收,扣除x吸收,可求y,c)x,y组分不能直接测定A1=exl1bcx+eyl1bcy(在1处测得A1)A2=exl2bcx+eyl2bcy(在2处测得A2),56,3.光度滴定,57,典型的光度滴定曲线,依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。,58,4.络合物组成的测定,(1)摩尔比法:固定cM,改变cR,59,(2)等摩尔连续变化法:,60,表观形成常数的测定(设M、R均无吸收),c(M)=c(R)=c,MmRn型?,61,5.一元弱酸离解常数的测定,HL HL,KaH+L/
15、HL,高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得AHLHLc(HL)；低酸度下，几乎全部以L存在，可测得AL Lc(HL).代入整理：,或,配制一系列c相同,pH不同的溶液,测A.,62,MO吸收曲线,由每份溶液的一对pH、A，可求得一个Ka,取平均值即可.,63,MO离解常数的测定作图法,64,6.双波长分光光度法消除干扰,在2，A2=Ax2+Ay2在1，A1=Ax1+Ay1,A=A2-A1=Ax2+Ay2(Ax1+Ay1)=Ax2 Ax1=Ax,Ay2 Ay1,Ax=(x2 x1)bcx消除了y的干扰,65,双波长分光光度法消除浑浊背景干扰,1 2,A 1-A 2=A Ac,例 牛奶中微量Fe的
16、测定,66,7.导数分光光度法(不要求),A图,混合物导数光谱,0,1,2,3,4,67,常药降压片中氢氯噻嗪含量的测定,1.氢氯噻嗪.2.硫酸双肼肽嗪3.盐酸可乐定4.常药降压片,68,肝中茚满二酮类抗凝血杀鼠剂的固相萃取,方法：肝匀浆用乙腈浸提，浸提液用6的HClO4稀释，然后用GDX100大孔树脂萃取，用二氯甲烷5mL洗脱杀鼠剂，40挥干，剩余物用0.1molL-1NaOH4mL溶解后，紫外导数光谱测定。,a.空白肝普通光谱b.2.5 mg/L敌鼠溶液的普通光谱c.空白肝二阶导数光谱d.2.5 mg/L敌鼠溶液的二阶导数光谱,69,8.1 了解分子对光的吸收与溶液颜色的关系.吸收曲线定性分析的基础。定量分析的基础朗伯-比尔定律：A=bc=-lgT 式中各参数的物理意义，定量计算。8.2 了解目视比色法、分光光度法的特点，分光光度计的基本部件。8.3 灵敏度的表示摩尔吸光系数的意义和计算；准确度适宜的测量范围、偏离比尔定律的原因。8.4 显色反应及条件的确定:显色剂用量、酸度、时间、温度、干扰及消除。8.5 应用:单一组分测定示例、多组分测定、光度滴定、络合物组成的测定、酸碱离解常数的测定。,第八章 小 结,
