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1、噻托溴铵对哮喘模型小鼠气道炎症与气道重塑的治疗作用,Effect of tiotropium bromide on airway inflammation and remodeling in a mouse model of asthma From：Clinical and Experimental Allergy,前 言,支气管哮喘是一种有嗜酸性粒细胞，肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎性细胞参与的以气道慢性炎症为特征的疾病。这种气道炎症是易感者对各种激发因子具有气道反应性，并可引起气道狭窄，表现为反复发作性的喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽等症状。其存在的病因杂而多，包括遗传的、环境的、药物的、精神的
2、等等。,前 言,哮喘的发病机制归结为四种：变态反应气道炎症 气道高反应性 神经机制,内 容,研究背景,一、哮喘特征：气流阻塞 气道炎症性气道高反应性 二、炎症细胞：肥大细胞 淋巴细胞嗜酸性粒细胞,研究背景,一、哮喘的典型活性介质：IL4 IL5IL13 IFNTGF二、活性介质与哮喘的关系：与Th1细胞的关系 与Th2细胞的关系与嗜酸性粒细胞（EOS）的关系,研究背景,噻托溴铵(商品名思立华)是目前世界上推崇的新型抗胆碱能药物，它是一种季铵类抗胆碱能类支气管扩张剂，对支气管扩张作用可持续24 小时，明显改善喘鸣及气促的症状，显著提高肺功能。因而，本实验的目的是评估噻托溴铵是否可以抑制哮喘模型小
3、鼠变态反应导致的急性与慢性气道炎症、Th2类型细胞因子产生以及气道重塑。,实验材料与方法,实验动物：BALB/c小鼠、雌性、6-8周、重量19-24 g试 剂：卵清蛋白（OVA）Sigma 噻托溴铵Boehringer Ingelheim 4-二苯乙酰氧基-N-甲基-哌啶甲碘 化物（4-DAMP）Boehringer Ingelheim,实验流程图,检测指标,动物造模,记录并分析结果,给药,BALF,肺病理,气道反应,离体细胞,PBMCs,急性和慢性气道炎症小鼠模型的建立,Day 0,Day 12,Day 0,Day 12,Day 21-23,Day 23-26,Day21-63,50 g/m
4、ouse OVA i.p.,0.1mM(50 g/mL)Inhalation for 3 min/mouse,2.5%OVA inhalation for 20 min/mouse,气道反应的测量,操作流程：麻醉小鼠 插管 装箱测 量 记录结果计算公式：(吸入5-羟色胺后的气道阻力/吸入前的气道阻力)100%,支气管肺泡灌洗和细胞的分析,操作流程：处死动物 钝性分离气管 固定气管 生理盐水冲洗 收集BALF 冰块保存 离心收集细胞 细胞冲洗与悬浮 细胞计数 细胞分类,肺组织病理分析,操作流程：提取BALF后 打开胸腔 剪取肺组织 PBS浸泡过夜 乙醇脱 水 包蜡 染色显微镜观察 分析指 标上皮
5、细胞增生、气道平滑肌增生、胶原纤维沉积、M3受体,脾细胞因子的测量,操作流程：分离脾细胞 悬浮培养 添加噻托溴铵 OVA（100 g/mL)刺激获取培养上清液 测量细胞因子培养液成分：RPMI 1640、胎儿牛血清和 抗生素细胞悬浮浓度：4.0106 个/mL.,人类外周血单核细胞因子的测量,操作流程：获取患者全血 分离PBMC 细胞培养 植物血凝素（PHA）激发噻托溴铵治疗 获取细胞培养液上清 ELISA测量IL5与IL13分离方法：运用淋巴细胞分离器采取密度梯度离心法,细胞因子的测量,操作方法：酶联免疫吸附测定法（ELISA法）检测样品：BALF与细胞培养上清 因子种类：IL4、IL5、I
6、L13、IFN、TGF1,实验结果,一、对气道炎症反应的影响 噻托溴铵能有效地防止变态反应导致 的急性炎症反应 噻托溴铵能同样有效地抑制慢性哮喘 模型小鼠的炎症反应,实验结果,二、对支气管肺泡灌洗液中Th2类型细 胞因子水平的影响 选取并被测量的细胞因子是IL4、IL5与IL13，这三者与哮喘的发生和发展有着密切的关系。同时，慢性模型还考虑了TGF-1，然而，噻托溴铵对模型小鼠中IgE的含量影响不大。,实验结果,三、对气道重塑的作用 气道重塑涉及到上皮细胞增生、嗜酸性粒细胞募集、-肌动蛋白增多、气道纤维化等病理改变，因而，可以从这几项指标检测噻托溴铵对气道重塑的改善作用。同时由于M3受体的发现
7、，为阐明其作用机制提供可能的依据。,实验结果,四、慢性哮喘模型小鼠气道高反应性 气道高反应性是哮喘的典型特征，尤其在慢性哮喘中表现明显，这可通过测量气道阻力来反映是否具有气道高反应性。,实验结果,五、对脾细胞因子的含量的影响由于在BALF中已证实体内噻托溴铵对细胞因子的抑制作用，因而需进一步证明在体外其对细胞的直接作用。通过脾细胞离体培养，再测量特定细胞因子的含量从而确定其体外活性。同时也验证了DAMP的作用。,实验结果,六、对患者外周血单核细胞因子 的含量的影响 选取哮喘典型的细胞因子IL5与IL13，从临床患者的角度直接考察噻托溴铵的治疗作用。,讨 论,一、改善气道重塑的可能作用机制 实验
8、结果已证实噻托溴铵能抑制急性与慢性气道炎症、降低Th2类型细胞因子水平，而Th2类型细胞因子能直接诱导上皮细胞增生，同时，上皮细胞增生是气道重塑的重要因素，因而其改善气道重塑可能与其抑制T细胞分泌Th2类型细胞因子有一定的关联。另外，TGF-能诱导成纤维细胞增殖、分化以及肌纤维母细胞外基质蛋白的合成、粘蛋白的形成。因此,降低TGF-1的生成，也可能与噻托溴铵改善气道重塑有直接或间接的关系。,讨 论,二、对Th2类型细胞因子可能作用机制 体内与体外实验已证实噻托溴铵对IL5、IL13与IFN具有直接抑制作用，但IL4的体内体外实验却有明显的区别，这表明其并非直接作用于IL4，而IL4在哮喘发生发
9、展中具有重要的调控作用，因而需要进一步研究其对IL4的作用机制。另外，血浆中IgE浓度变化实验已证实噻托溴铵的抗炎作用只局限于气道，并非全身。还有乙酰胆碱能促进细胞因子的产生，但体外实验是在缺乏乙酰胆碱下进行的，这表明抑制T细胞信号传导并不只局限于拮抗受体作用。,讨 论,三、与M3受体的作用 实验已证实模型小鼠的M3受体出现在气道平滑肌细胞、炎症细胞、上皮细胞以及嗜酸性粒细胞上，由于M3受体的辅助，噻托溴铵对气道炎症具有广谱作用，因此，这促使我们去研究噻托溴铵治疗作用的最初靶点。同时，内源性的乙酰胆碱在气道炎症与气道重塑的发生与发展发挥重要的作用，这表明噻托溴铵的治疗作用与胆碱途径（经M3受体激活T细胞）密切相关，但这并非唯一，可能还与JAK-STAT途径以及NF-B信号通路等因素有关，这还需进一步研究与论证。,THANKS,
