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1、7.5植物脱毒苗的检测与保存,植物病毒的侵染与传播植物病毒的鉴定与检测无毒原种苗的保存与应用,植物的侵染与传播,（1）植物病毒的侵染 侵染途径：借助外力，通过植物细胞的微伤或刺吸口器昆虫的口针，把病毒送入植物细胞内。如何进行繁殖：病毒的核酸起决定性作用。病毒的核酸具有复制自己的能力，这种能力成为遗传信息，大多数都是由RNA组成。病毒粒体进入植物细胞，脱掉外壳蛋白质后，核酸就开始繁殖。,（2）植物病毒的传播 植物病毒是一种专性寄生物，在寄生体体外的存活期一般比较短，其近距离传播主要靠活体接触摩擦，远距离传播则依靠寄生的繁殖材料和昆虫体等,1.介体传播 a.昆虫传播：能作为介体的昆虫绝大多数是具有
2、刺吸口器，其中以蚜虫占首位。b.线虫传播：线虫在土壤中进行传播，它们也像蚜虫那样有一种刺吸的习性。c.螨传播：传播病毒的螨分别属于瘿螨科和叶螨科，两者都是刺吸式口器。叶螨在吸食式，也吐唾液，然后把病毒和细胞汁液一起吸入。,2.接触传播a.自然接触传播：如风，雨等促使植物地上部分接触及根在地下接触等。b.汁液接触传播：这是试验研究中常用的接种方法。用感染株汁液在另一寄生体表面摩擦，通过微伤侵入。C.人为接触传播：移苗整枝摘芽打杈修剪中耕除草等农事操作也可以传播病毒。d.嫁接及莬丝子的“桥接”传播：将接毒植株做接穗，通过嫁接传播。莬丝子能从一种植物缠绕在另一种植物上，可以看作是 一种变相的嫁接，把
3、病株传到健株。e.种子传播：主要是豆科植物可以通过种子传播。,植物病毒的鉴定和检测,（1）指示植物法（2）抗血清鉴定法（3）电子显微镜鉴定法（4）酶联免疫测定法,(1)指示植物法,概念：利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的标准。又称枯斑和空斑测定法。这种专门选用以产生局部病斑的寄生即为指示植物（indicator plant),又称鉴别寄主。注意：它只能用来鉴定靠汁液传播的病毒。指示植物类型：一种接种后产生系统性症状，病毒 在扩展到植物非接种部位，通常没有明显局部病斑；另一种是只产生局部病斑，常表现出坏死.褪绿或环斑。,指示植物的要求：一年四季都可栽培，并在较长时期内保持对病毒的敏
4、感性，容易接种，在较广的范围内具有同样的反应。鉴定方法；P182对于多年生木本果树植物及草莓等无性繁殖的草本植物，通常采用嫁接接种的方法。,（2）抗血清鉴定法,血清反应：植物病毒是由于蛋白质和核酸组成的核蛋白，因而是一种较好的抗原，给动物注射后会产生抗体，这种抗原和抗体所引起的凝聚或沉淀反应就称为血清反应。抗血清：抗体是动物在外来抗原的刺激下产生的一种免疫球蛋白，抗体主要存在于血清中，故含有抗体的血清称为抗血清。抗血清法：不同病毒产生的抗血清都有各自的特异性，因此，用已知病毒的抗血清可以鉴定未知病毒的种类。,优点：特异性高，检测速度快，一般几个小时甚至几分钟就可以完成。可以用来鉴定同一病毒的不
5、同株系以及测定病毒浓度的大小。它是最有用的方法之一。方法：主要依据沉淀反应原理，具体有试管沉淀试验，点滴沉淀试验，凝聚十月，凝聚扩散试验等多种测试鉴定方法。,（3）电子显微镜鉴定法,主要方法是直接利用病株粗汁液或用纯化的病毒悬浮液和电子密度高的负染色剂混合，然后点在电镜铜网支持膜上观察，也可将材料制作成超薄切片，然后分别在1500倍，2000倍，3000倍下观察，能够清楚地看到细胞内的各种细胞器中有无病毒粒子存在，并可得知有关病毒粒体的大小，形状和结构，由于这些特征是相当稳定的，如果取材时期合适，则鉴别准确，故对病毒鉴定是和重要的。,（4）酶联免疫测定法,优点：极高的灵敏度，特意性强，安全快速
6、和容易观察结果。ELISA法的原理是把抗原与抗体的免疫反应和酶的高效催化作用结合起来，形成一种酶标记的免疫复合物。结合在该复合物上的酶，遇到相应的底物时，催化无色的底物产生水解，形成有色的产物，从而可以用肉眼观察或用比色法定性，定量判断结果。,双抗夹心ELSA（DAS-ELISA）法是诸多的ELISA方法中，重复性好，检测敏感性高，的一种，得到更广泛的应用。原理：将一种纯化的特异性抗体或含有特异性抗体的抗血清，吸附在固相载体表面，洗除末吸附抗体后，加入一定量待测样品，在固相载体表面形成抗体-抗原复合物。,DAS-ELISA标准操作程序：1 实验试剂及溶液的配制：本标准所用试剂，凡未指明规格者，
7、均为分析春纯，蒸馏水配制 a 包被缓冲液 b 洗涤缓冲液 c 磨碎缓冲液 d 底物缓冲液 e 底物溶液 f 终止液,2 操作程序 a 用包被抗体包被酶标板 b 准备样品 c 洗板 d 加样 e 准备酶标特异抗体 f 洗板 g 加酶标特异抗体 h 准备酶底物 I 洗板 j 加入酶底物溶液 k 结果判定,无毒原苗的保存和应用,无毒原苗的保存（1）隔离种植保存 通常无毒原种要在隔离区或隔虫网室内种植保存。隔离区可以为海岛山地未种植过该种（有时是属甚至科）植物的新区。隔虫网室以使用300目的网纱为好，网眼为0.40.5mm大小的规格，可以防止蚜虫的进入。种植圃的土壤也应该消毒。注意：定期进行重感病毒的检测，一旦反省隔离区内有重感植株时，应采取果断措施排除病毒再次传播,（2）离体保存脱毒种苗经鉴定后，选择无病原种株系，回接于试管内，可长期保存，是最理想的保存方法。,无毒原种的应用 一方面要积极进行无毒苗的推广，另一方面还要做好无病毒种的繁殖。无毒苗的推广应在发展良种的新区使用才可以取得良好的效果，在老病区使用时应该实行统一的防治措施，一次性全区换种，才能取得应有的效果。,无病毒原种的繁殖可在无毒源和其他病虫害的大田中进行，场地土壤要进行消毒，防治蚜虫线虫和其他传毒媒介，并建立一套严格的原种繁育制度和栽培管理制度，防止病毒的再次感染。,414,成员：谢敏亮 涂明智 石锦桥 刘晶生,
