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1、第三章 物理图绘制,3.1 概述3.2 限制性作图 3.3 荧光原位杂交3.4 序列标记位点作图3.5 克隆作图3.6 遗传图与物理图的整合,3 Physical mapping3.1 概述,为什么要进行物理作图？遗传学图谱分辨率有限遗传学图的分辨率依赖于得到的交换的数目。对于人类与大多数真核生物来说，巨大数量的后代不易获得。遗传学图谱精确度有限,酿酒酵母chr3遗传图与物理图的比较,3 Physical mapping3.1 概述,结构基因组学的发展：遗传作图物理作图 基因组测序,物理作图的主要环节,3 Physical mapping3.1 概述,物理作图的主要方法,限制性作图（restr
2、iction mapping)荧光原位杂交（fluorescent hybridization,FISH)序列标签位点（STS)作图（sequence tagged sites mapping),3 Physical mapping3.1 概述,限制性作图 定义：将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。局限性：只能应用于相对较小的DNA分子。,3 Physical mapping3.2 限制酶作图,限制性作图的基本原理,比较一种DNA分子被不同限制性内切酶切割所产生的片段大小。首先用一种酶处理样品后，电泳确定DNA片段的大小。然后用第二种酶处理，获得第二组片段。最后用两种酶混合处理，获得第
3、三组片段。收集上述资料进行对比组装。两种酶切位点交替出现的区段用加减法确定其的相对位置。连续出现2个或多个相同酶切位点的区段，采用部分酶解法。切点过多时可以采用末端同位素标记结合部分酶解进行绘图。,3 Physical mapping3.2 限制酶作图,3 Physical mapping3.2 限制酶作图,限制酶作图的基本方法,8,结论：图谱II是正确的,双限制性酶切图解,片段 结论,0.2kb,0.5kb 必然来自0.7kb的BamHI片段，其中有一个EcoRI的位点,1.0kb 这必然是一个不含EcoRI位点的BamHI片段，如果我们如下放置1.0kb的片段，就可以解释1.5kbEcoR
4、I片段的出现,1.2kb,2.0kb 这必然也是不含EcoRI位点的BamHI片段，它们必须位于3.4kb的EcoRI片段中。这样就有两种可能：,BamHI部分限制性酶切的预测如果图谱I是正确的，不完全消化产物应该包括1.2+0.7=1.9kb的片段如果图谱I是正确的，不完全消化产物应该包括2.0+0.7=2.7kb的片段,BamHI亚适条件,限制性作图的规模受限于限制性片段的大小 限制性片段越大，切点越多，需要比较的片段也会增加，而且当片段多到一定程度，一些大小相似的片段会重叠在一起，不可能组成一个清晰的图谱。因此，限制性作图更适合于小分子。实际应用中如果DNA分子小于50kb，通常可以选用
5、识别6个核苷酸序列的限制酶来建立清晰的限制性图谱。,3 Physical mapping3.2 限制酶作图,3 Physical mapping3.2 限制酶作图,大于50kb的基因组能否用限制性作图？,答案是肯定的。通过选择靶DNA分子中的稀有酶切位点酶可以克服限制性酶切作图的局限性。稀有切点内切酶:在基因组DNA顺序中只有很少可识别序列的限制酶,一般识别位点在6-8碱基对之间,并含有高G/C比。稀有切点限制酶分为两大类：识别具有7或8个核苷酸序列的酶；识别序列包含靶DNA稀少基序的酶。,选用稀有切点限制酶的注意事项,识别顺序越长产生的片段越大，但当识别位点含非特异顺序时，片段长度小于预期；
6、识别位点的碱基组成影响限制性片段的大小。高等生物基因组一般A/T比较高,应选G/C 高比例限制酶,如-GC GGCCGC-(NotI)限制酶识别位点较长，即使高等真核生物基因组也没有这种序列，可以通过转座或转导将这类酶切位点引入待测基因组；基因组DNA甲基化对酶切位点出现频率的影响。高等生物基因组DNA甲基化比例很高,但果蝇和酵母基因组无甲基化。,3 Physical mapping3.2 限制酶作图,稀有切点限制酶在物理作图中的应用低等生物基因组物理作图大分子DNA克隆片段的物理作图,3 Physical mapping3.2 限制酶作图,3 Physical mapping3.2 限制酶作
7、图,选用稀有切点限制酶酶切大片段DNA预测稀有切点限制性内切酶酶切片段大小,1)根据稀有酶切位点限制酶识别碱基数推测产生的DNA 片段长段:NotI 酶:GC/GGCCGC 48=74 536 bp=75 kb I-SceI 酶:TAGGGATAA/CAGGGTAAT 418=90 000 000 bp=90 000 kb2)由于多细胞真核生物基因组DNA存在大量的甲基化位点,识别CG序列的稀有酶切点限制酶实际产生的DNA片段比预期大得多.如NotI酶切人类基因组DNA产生的片段常在200 kb以上，平均长度达到1Mb。,PFGE的基本原理 将一个方向不断变换的电场，取代简单的单一电场（单向电
8、场，使电泳中受阻的DNA分子在电场改变时扭转迁移方向，较小的分子比较大的分子重新排列的快，以此达到分离的目的。分辨率达到10Mb。,大片段DNA的分离技术脉冲凝胶电泳,3 Physical mapping3.2 限制酶作图,垂直交变电场电泳,垂直交变电场(OFAGE)，有2对电极，分别位于凝胶对角线的两端，2对电极轮流接通电场，产生一个交替的方向不同的电场，DNA分子在凝胶中不断改变迁移方向。交变电场电泳主要用于相对分子量较大的DNA分子的分离。,3 Physical mapping3.2 限制酶作图,大肠杆菌基因组物理图,3 Physical mapping3.2限制酶作图,DNA分子限制性
9、位点的直接检测光学作图,光学作图：直接在显微镜下观察检测限制性酶切位点。凝胶拉伸：将染色体DNA悬浮于融化的琼脂糖中，然后滴加到用限制酶包被的显微载波片上，当凝胶冷却时DNA分子呈伸展状态。然后用加入氯化镁激活限制酶，切割DNA分子，同时加入荧光染料使DNA分子染色，延伸的分子中的限制性酶切位点就逐渐形成缺口，可用高分辨率的荧光显微镜检测到。分子梳理：将硅胶树脂包被的盖玻片浸入DNA溶液中，保留5分钟，使DNA分子的末端黏附于盖玻片上，然后以0.3mm/s的速度移动玻片，使DNA分子整齐排列在盖玻片表面，然后再加入限制性酶和荧光染料，就可以在荧光显微镜下检测到酶切的缺口。,耐辐射球菌(Dein
10、ococcus radiodurans)基因组NheI酶切图,3 Physical mapping3.3 荧光原位杂交,荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）指在染色体上进行DNA杂交，以便识别荧光标记探针在染色体上位置的方法。,原位杂交的操作 染色体分裂细胞 染色体变性 检测信号早期的原位杂交用的标记是放射性标记，但放射性标记很难同时满足灵敏度和分辨率两个原位杂交的必要条件。20世纪80年代发展起来的荧光标记解决了这一矛盾。为了得到高灵敏度，探针的标记量要尽可能大一些，以往的探针至少40kb。现在由于强信号荧光物质的发现和重标记技术的发明
11、，对探针长度的要求已经不那么严格了。,3 Physical mapping3.3 荧光原位杂交,甲酰胺处理,加入探针,杂交探针非特异位点的封闭,如何提高荧光原位杂交的分辨率？,原位杂交的分辨率与染色体的制备有关：中期染色体分辨率1000kb，主要用于发现新的分子标记属于哪条染色体；机械伸展的中期染色体分辨率200300kb；非中期染色体分辨率可达到25kb以下。用特殊技术制备的纯化 DNA可以进行纤维-FISH，分辨率可达到10kb以下。,3 Physical mapping3.3 荧光原位杂交,3 Physical mapping3.4 序列标记位点作图,序列标记位点作图大基因组物理图主流构
12、建技术,限制性酶切作图和FISH的优缺点限制性酶切作图快速、简便，能提供详细定位信息，但不能用于大基因组。FISH可以用于大基因组，但难于操作，数据积累慢，一次实验定位的标记不超过3-4个。,序列标记位点（Sequence tagged site,STS）:指一段短的DNA序列,通常长度在100-500bp,易于识别,在待研究的染色体或基因组中仅存有1个拷贝。因此当2个片段含有同一STS顺序时，可以确认这两个片段彼此重叠。序列标记位点作图：通过PCR或分子杂交将特定DNA顺序定位在基因组染色体区段中。,3 Physical mapping3.4 序列标记位点作图,STS作图的原理,两个STS出
13、现在同一片段的机会取决于他们在基因组中的距离，彼此靠的越近，分离的几率越小，彼此相隔越远，分离的几率越大。两个STS之间相对距离的估算与连锁分析的原理一样，它们之间的图距根据它们的分离频率来算。,3 Physical mapping3.4 序列标记位点作图,3 Physical mapping3.4 序列标记位点作图,STS作图原理图示(1),STS作图原理图示(2),3 Physical mapping3.4 序列标记位点作图,STS需要具备的两个条件：1）在染色体上的位置独一无二；2）序列已知，方便PCR检测。,寻找STS的方法：1）表达序列标签（expressed sequence ta
14、g,ETS)：来源于cDNA克隆的小段序列。EST来自单拷贝的基因时可作为STS；2）SSLP 具有多态性且通过连锁分析进行定位的SSLP很有价值，可以建立遗传图与物理图之间的联系；3）随机基因组顺序。可通过对克隆的基因组DNA随机测序获得，或者从数据库中寻找。,STS作图的DNA片段群作图试剂（mapping reagent)：STS作图过程中用到的可覆盖待研究的染色体或基因组的DNA片段群。如何获得作图试剂？1）放射杂交 2）克隆文库,3 Physical mapping3.4 序列标记位点作图,1）放射杂交,辐射杂种（radiation hybrid)：含有其他生物染色体片段的啮齿类动物
15、细胞。辐射杂种群（radiation hybrid panel)：通过放射杂交产生的融合细胞群称为辐射杂种群。辐射杂种群分为两类：全基因组辐射杂种群单染色体辐射杂种群,染色体,片段化染色体,辐射杂种,X射线照射,细胞融合,全基因组辐射杂种的筛选,使用不能产生胸腺激酶（TK)或者次黄嘌呤磷酸转移酶（HPRT)的仓鼠细胞系作受体。这种细胞在添加了次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基（HAT）中不能存活。只有获得人体DNA中TK和HPRT基因的仓鼠细胞才能在HAT选择性培养基中生长。,辐 射 杂 种 作 图,单染色体辐射杂种群,3 Physical mapping3.4 序列标记位点作图,构建：用x射线
16、照射另外一类含一条人染色体的啮齿类（如小鼠）细胞系，再将这种细胞与仓鼠细胞融合。筛选：用人类基因组广泛分布的重复序列如Alu（一类SINE)做探针，筛选只含有人染色体片段的杂种细胞。,辐射杂种群用于作图试剂的条件,3 Physical mapping3.4 序列标记位点作图,使用PCR方法鉴定STS时，不会从仓鼠基因组或者小鼠基因组扩增出相应的片段。,辐射杂种作图的单位厘镭（centiRay,cM)：DNA分子暴露在N拉德x射线剂量下，两个分子标记之间发生1%段裂的频率。,人类21号染色体辐射杂种图,一段人类染色体DNA的辐射杂种图,人类基因组辐射杂种图距,染色体 物理长度（Mb）cM/cR
17、kb/cR 平均滯留率（范围）1 263 0.20 197 21.1(14.3-50.6)2 255 0.21 225 23.8(14.3-37.5)3 214 0.27 233 26.9(14.3-41.1)4 203 0.28 256 24.3(11.3-44.0)5 194 0.29 272 26.9(17.3-49.4)6 183 0.24 243 30.6(21.4-49.4)7 171 0.23 229 27.7(19.0-44.6)8 155 0.26 271 31.0(31.0-45.8)9 145 0.38 305 22.1(14.3-27.4)10 144 0.26 253
18、 28.5(16.2-56.3)11 144 0.30 270 25.7(20.2-38.7)12 143 0.21 234 32.1(23.2-50.6)13q 98 0.22 179 22.9(16.7-36.3)14q 93 0.34 208 32.0(21.1-57.1)15q 89 0.36 203 31.7(24.4-45.2)16 98 0.43 201 30.5(21.6-39.9)17 92 0.23 147 61.6(33.9-93.5)18 85 0.30 172 34.3(20.7-43.5)19 67 0.20 110 32.2(21.4-45.8)20 72 0.3
19、0 191 31.0(16.1-41.1)21q 39 0.31 151 50.1(39.3-71.3)22q 43 0.95 185 36.6(30.4-50.6)X 164 0.31 231 18.4(11.9-30.4)基因组),2）克隆文库克隆文库：将基因组或分离的染色体断裂成片段，克隆到高容量载体中所产生的DNA片段的集合。克隆文库STS作图的优势：单独的克隆就可以提供测序的DNA，来自STS分析的数据可用来构建物理图谱，也可以确定含有重叠DNA片段的克隆，这就可以帮助我们建立克隆重叠群。,3 Physical mapping3.4 序列标记位点作图,绘制物理图的克隆文库,全基因组D
20、NA文库单一染色体DNA文库,3 Physical mapping3.4 序列标记位点作图,流式细胞计数仪工作原理,YAC载体:YAC(Yeast artificial chromosome)即酵母人工染色体，具有酵母染色体的特性，以酵母细胞为宿主，能在酵母细胞中复制。以YAC为载体，可以乘载1.4Mb的大片段DNA，是物理作图中最早利用的大片段DNA载体。优点:容量大,插入片段可达1400 kb.缺点:转化效率低；插入子稳定性差；嵌合克隆比例高,达48%；插入DNA的制备相当困难。,3 Physical mapping3.5克隆作图,构建图谱的载体与方法,克隆作图：根据克隆的DNA片段之间的
21、重叠顺序构建重叠群(Contig),绘制物理连锁图。,酵母人工染色体(YAC),BAC载体:,BAC(Bacterial artificial chromosome)即细菌人工染色体，具有细菌染色体的特性，以细菌细胞为宿主，能在细菌细胞中复制。以BAC为载体，可以乘载约300kb的大片段DNA，是物理作图中目前用得最多的大片段DNA载体。优点：单拷贝复制，不会因重组发生嵌合；插入DNA的 提取简单，便于机械化操作。,细菌人工染色体（BAC）,PAC载体：PAC（P1-derivedartificialchromosome)P1人工染色体插入的外源DNA没有明显的嵌合和缺失象；可以插入约300k
22、b的外源片段；可以稳定遗传及高效扩增。PAC除具有许多BAC载体的特征外,它的多克隆位点位于蔗糖诱导型致死基因sacB上,通过加入蔗糖和抗生素的培养基筛选出来的克隆都是含有插入片段的重组子。但是,PAC载体自身片段较大(约16kb),构建文库没有BAC载体(约78kb)效率高。,PAC载体,染色体步移法（chromosomal walking)指纹法(clone fingerprinting),3 Physical mapping3.5克隆作图,克隆重叠群的组建,染色体步移法,先从基因文库的一个克隆开始，然后从文库中寻找与之重叠的第二个克隆，再继续确定第三个克隆，依次类推。这是最早发明的拼接克
23、隆重叠群的方法。如果探针含有基因组范围分布的重复序列，会有非特异杂交，这时需要预杂交，封闭非特异位点。以插入片段末端为探针，减少重复序列出现的可能性。如果探针序列已知，可以通过PCR筛选。染色体步移的缺点是速度缓慢，只适合小基因组或小区段染色体物理图绘制。,染色体步移,用探针进行染色体步查,用PCR进行染色体步查,克隆指纹法的原理：如果2个克隆彼此重叠，它们一定含有相同的顺序。基因组范围内查找重叠克隆的最好方法首推克隆指纹排序。指纹：指确定DNA样品所具有的特定DNA片段组成，一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的指定序列的特征，可以同其他克隆产生的同类指纹比较。,3 Physical mappi
24、ng3.5克隆作图,指纹法,限制性带型指纹,定义：用不同限制性酶消化后，经凝胶分离产生的条带。,重复顺序DNA指纹,定义：将不同克隆的限制性片段电泳转膜后，与基因组范围分布的重复序列杂交形成的带型。,重复顺序DNA PCR或分散重复顺序PCR,定义：用基因组范围的重复序列的互补序列做引物，扩增两个重复序列之间的单一顺序，得到的产物带型。,STS目录作图,定义：根据STS序列设计引物，扩增文库当中的克隆，能扩出条带的克隆都含有顺序重叠的插入子。,YAC(700 kb)BAC(200 kb)基因组大小 单个 95%单个 95%（Mb）基因组 复盖率 基因组 复盖率酵母 14 20 59 70 20
25、9线虫 100 143 427 500 1496果蝇 170 243 726 850 2545鼠 3000 4286 12838 15000 44935人类 3000 4286 12838 15000 44935拟南芥 100 143 427 500 1496玉米 2500 357210698 12500 37445番茄 950 1357 4064 4750 14228大麦 5300 757222681 26500 79386水稻 450 643 1924 2250 6739火炬松 20000 2857185591 100000 299572,利用平均长度为700 kb(YAC)和200 kb
26、(BAC)的插入子构建95%基因组复盖率的物理图谱所需的克隆数,遗传图物理图的整合,1）1987年，发表遗传图，含403个标记，密度为10Mb；2)1994年,发表遗传图,含5 800个标记,密度为0.7 Mb.3)1993年，发表重叠群物理图，含33000个YAC;4)1995年,发表STS图,含15 086 个标记,密度为199 kb.5)1996年,发表遗传图,含7050个标记,密度为600kb.6)1996年,发表物理图,含17 096 个标记,密 度达 100 kb.7)STS图中含 7 000多个SSLP,使遗传图与物理图彼此衔接,成为测序的框架图.,人类基因组图,3 Physical mapping3.5克隆作图,本章小结,名词解释限制性作图、稀有切点内切酶、荧光原位杂交、序列标记位点、序列标记位点作图、作图试剂、辐射杂种、辐射杂种群、克隆文库、指纹问答1、物理作图的主要方法有哪些？原理分别是什么？各有什么优缺点？2、什么叫序列标记位点？序列标记位点需要具备什么条件？如何在基因组当中寻找序列标记位点？3、如何组建克隆重叠群？4、克隆指纹有哪些类型？如何应用这些指纹进行分析？,
