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1、离心分离技术,第四章,固液分离：第一选择为过滤，第二选择为离心分离。应用：A、难过滤的发酵液（d小、大、过滤v慢）、甚至不能过滤的悬浮液，及忌用助滤剂、或助滤剂无效的悬浮液；B、其他难分离的固液分离；C、互不相溶的液液分离，如液液萃取；D、不同密度固体或乳浊液的密度梯度分离，如超离心分离缺点：A、分离得到的不是滤饼一样的半干物，而是浆状物；B、处理量小；C、设备复杂，价格贵，分离成本高。,离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。,离心分离,4.1 离心沉降,当悬浮液静止不动时，由于重力场的作用，较大的悬浮颗粒会逐渐沉降，颗粒越重下沉越快，反之
2、会上浮。但很小的颗粒不仅沉降速度慢，而且扩散现象严重，很难或根本无法沉降。这样就需离心的方法产生出离心力场，使之产生沉降。,一、离心沉降原理,1、离心力（centrifugal force，Fc）离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度2X与颗粒质量m的乘积，即：其中是旋转角速度，以弧度/秒为单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位；m是质量，以克为单位。,根据Fr对离心机分类：常速离心机:Fr3000g 中速离心机:3000g Fr 50000g 高速离心机:Fr 50000g 超高速离心机:Fr=20000-1
3、000000g,同一样品在不同的离心机上离心力不同,2、相对离心力（relative centrifugal force，RCF）常用“相对离心力”或“数字g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转子每分钟的转数（rpm）。,在说明离心条件时，低速离心通常以转子每分钟的转数表示（r/min），如4000 rpm；而在高速离心时，特别是在超速离心时，往往用相对离心力来表示，如65000g。,3、沉降系数（sedimentati
4、on coefficient，s）根据1924年Svedberg对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。以Svedberg表示，简称S。沉降系数S与分子量M有对应关系：R气体常数；T温度（K）；S沉降系数（s）；D粒子扩散系数；粒子的偏比容（粒子密度的倒数）；溶剂密度。,4、沉降速度（sedimentation velocity）沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。式中r为球形粒子半径；d为球形粒子直径；为流体介质的粘度；P为粒子的密度；m为介质的密度。从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子的密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度
5、也增加。,当Pm，则S0，粒子顺着离心方向沉降。当Pm，则S0，粒子到达某一位置后达到平衡。当Pm，则S0，粒子逆着离心方向上浮。,5、沉降时间（sedimentation time，Ts）式中：Xmax为离心转轴中心至离心管底内壁的距离；Xmin为离心转轴至样品溶液弯月面之间的距离；Ts以小时为单位，S以Svedberg为单位。6、K系数（k factor）K系数是用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。其中Rmax为转子最大半径；Rmin为转子最小半径。,二、离心沉降设备,离心机可分为工业用离心机和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性离心机和分析性离心机。制备性离心机主要用于分离各种
6、生物材料，每次分离的样品容量比较大;分析性离心机一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测），能推断物质的纯度、形状和相对分子质量等。分析性离心机都是超速离心机。,瓶式离心机管式离心机多室式离心机碟式离心机螺旋卸料沉降离心机,离心沉降设备,1.瓶式离心机,外摆式 角式 固定式,离心管 离心管主要用塑料和不锈钢制成：塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能较好。塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用：防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时
7、，这点尤其重要。防止样品挥发。支持离心管，防止离心管变形。,2.管式离心机,3.多室式离心机,缺点：出渣比较困难。,适用于处理直径大于0.1m的颗粒，固相浓度小于5%的悬浮液，常用于抗菌素液液萃取分离，果汁和酒类饮料的澄清等。,转鼓内有数个同心圆筒组成的环隙状分离室。各分离室的流道串联。操作时，悬浮液自中心进料管加入转鼓中，由内向外顺序流经各分离室。在逐渐增大的离心力作用下，悬浮液中的粗颗粒沉积在内部的分离室壁上，细颗粒沉积在外部的分离室壁上。,4.碟片式离心机,碟式离心机是立式离心机的一种，转鼓装在立轴上端，通过传动装置由电动机驱动而高速旋转。,转鼓内有一组锥顶角为60100度的的互相套叠在
8、一起的碟形零件-碟片。碟片与碟片间的距离用附于碟片背面的具有一定厚度的狭条来控制，碟片的距离为.52.5mm。,当转鼓连同碟片以高速旋转时，碟片间的悬浮液中的固体颗粒因其有较大的质量，优先沉降于碟片的内腹面，并连续向鼓壁方面沉降，澄清的液体则被迫反方向移动而在转颈部进液管周围的排液口排出。沉渣沿碟片表面滑动而脱离碟片并积聚在转鼓内直径最大的部位，分离后的液体从出液口排出转鼓。,.,碟片的结构是：1.碟片用薄的不锈钢冲成；2.碟片呈圆台形；3.在碟片上开有对称的孔。,碟式分离机转鼓内有一组碟片，把转鼓空间分成许多薄层分离空间，从而大大缩短沉降距离，改善和提高分离效果。任何处于两碟片之间的极限颗粒
9、若能在此路程段中到达碟片内表面，则可以被分离出来。,颗粒在分离空间内的运动路线,卸渣方式 a.人工排渣的碟片离心机 b.喷嘴排渣碟片式离心机 c.活门排渣碟片式离心机 d.活门排渣的喷嘴碟片式离心机,卧式螺旋卸料沉降离心机是利用离心沉降原理分离悬浮液的设备，它主要用于完成固液相有密度差的悬浮液的固相脱水，液相澄清，粒度分级，浓缩等工艺过程。,5.螺旋卸料沉降离心机,原理：转鼓与螺旋以一定差速同向高速旋转，物料由进料管连续引入输料螺旋内筒，加速后进入转鼓，在离心力场作用下，较重的固相物沉积在转鼓壁上形成沉渣层。输料螺旋将沉积的固相物连续不断定推至转鼓锥端，经排渣口排出机外，较轻的液相物则形成内层
10、液环，由转鼓大端溢流口连续溢出转鼓，经排液口排出机外。,LW型卧式螺旋卸料沉降离心机,4-2 离心过滤,一、离心过滤的原理,离心过滤是将料液送入有孔的转鼓并利用离心力场进行过滤的过程，以离心力为推动力完成过滤。兼有离心和过滤的双重作用。,滤饼,离心过滤机工作原理图,滤网,以间歇离心过滤为例，料液首先进入装有过滤介质(滤网或有孔套筒)的转鼓中，然后被加速到转鼓旋转速度，形成附着在鼓壁上的液环。与沉降式离心机一样，粒子受离心力而沉积，过滤介质则阻止粒子的通过，形成滤饼。当悬浮液的固体粒子沉积时，滤饼表面生成了澄清液，该澄清液透过滤饼层和过滤介质向外排出。,分批立式轴,分批卧式轴,二、离心过滤设备,
11、间歇式,连续推送式,连续锥形滤网,连续式,GT6H13 卧式离心过滤机 本机适宜过滤果汁或皮汁，达到液固体分离，提高汁的纯度。,自动连续卸料离心过滤机为(锥形转鼓),基本参数 选择颗粒d,固液差,基本型号 固体物浓度 亚型产物热稳定性 低温离心流量Q,规模 规格、台数气溶胶,活cell 密封灭菌设计,4.3 离心机的选用（P66）,离心机的选择,包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）,4.4 离心机在生物工业中的应用（P67）,4.5 超离心法,超离心法：根据物质的沉降系数、质量和形状不同，应用强大的离心力，将混合物中各组分分离、浓缩、提纯的方法。,一、超离心技术的原理,在某种介质中，使一种
12、球形粒子从液体的弯月面沉降到离心管某部(如底部)所需的时间：,当粒子直径和密度不同,移动同样距离所需的时间不同,在同样的沉降时间,其沉降位置也不同.,式中t为沉降时间，为悬浮介质的粘度，d为粒子直径，s为粒子密度，为介质密度；r1为旋转轴中心到液体弯月面的距离，r2为从旋转轴中心到离心管底部的距离。,利用它可以从组织匀浆中分离细胞器，其主要细胞成分的沉降顺序，一般先是整细胞和细胞碎片，然后是核、叶绿体、线粒体、溶酶体、微粒体和核蛋白体。,二、超离心技术的分类,差速离心,（一）制备性超离心,（二）分析性超离心,等密度离心,一般密度梯度离心法,密度梯度离心,采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度
13、不同的颗粒在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。,（一）制备性超离心,1、差速离心(Differential centrifugation),优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点：分离效果差；壁效应严重；颗粒被挤压。,2、密度梯度区带离心法,密度区带离心法是样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。,密度梯度系统：梯度介质有足够大的溶解度，不与分离组分反应，不会引起分离组分的凝集、变性或失活。样品铺在密度梯度溶液表面，离
14、心后形成若干条界面清楚的不连续区带。,优点：分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。,缺点：离心时间较长；需要制备梯度；操作严格，不宜掌握。,（1）一般密度梯度离心法 差速区带离心法（动态法或沉降速度法）（Diensity gradient centrifugation）,根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。,离心过程中区带的位置、形状随离心时间而改变用于分离有一定沉降系数差
15、的颗粒，与密度无关,把样品铺放在一个连续的液体密度梯度上，然后进行离心，并控制离心分离的时间，使得粒子完全沉降之前，在液体梯度中移动而形成不连续分离区带。该法仅用于分离有一定沉降系数差的粒子，与粒子密度无关。因此大小相同，密度不同的粒子(如线粒体、溶酶体和过氧物酶体)不能用此法分离。这种方法已用于RNADNA混合物、核蛋白体亚单位和其他细胞成分的分离。,（2）等密度离心（Isopycnic centrifugation）,指当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力作用下，颗粒或向下沉降或向上浮起，一直沿梯度移动到与其密度恰好相等的位置上（即等密度点），形成区带而分离的方法。,处于等密度点的颗粒没有
16、重量，区带的位置、形状均不受离心时间的影响，体系处于动态平衡。,差速区带离心法和等密度离心法的区别,等密度离心,差速区带离心,（二）分析性超离心,分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。,相对分子质量的测定（纹影光学、吸收扫描光学系统）大分子纯度的估计检测大分子中构相的变化,与制备用机型的不同点：1由于盛液器（离心池）有“光学窗口”，故受材料强度限制，允许转速略低，在80000rpm以内使用。2转速与温度直接影响测定数据，必须控制很严：转速偏差1.5，温差0.1 3附有动态光
17、学检测，数据分析系统。,三、密度梯度技术,步骤：A.形成密度梯度 B.加样 C.离心 D.收集样品,（一）密度梯度的作用:1、增加分离层次，提高分辨率。2、防止温差及振动造成的影响。（二）对密度梯度的基本要求：1、梯度介质应自身密度大，且溶解度足够大，以便制作出密度范围大的密度梯度。2、理化性质稳定，生物惰性；离子强度低，渗透压小，粘度小。3、具某种可测性（如折射率）以测其浓度（密度），但不干扰分离组分的测定。4、便于除去或回收。此外还有纯度，价格等因素。,(三)密度梯度的设计1.梯度介质的选用:(1)盐梯度介质(2)小分子有机物如蔗糖(3)三碘化苯衍生物(4)有机高聚物(5)胶态二氧化硅,蔗
18、糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。,
19、常见的密度梯度材料及应用,卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离其高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。Percoll：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。,2、梯度的密度范围：差速区带离心：最大密度 组份最大密度 盐介质离心形成的梯度范围与介质性质、起始浓度、离心力大小、两端旋转半径有关。,线形梯度：最常用,阶梯梯度：梯度容量大，分离快，
20、主要用于颗粒区带很靠近时的等密度区带离心。适用于亚细胞器、整细胞和病毒。,凹形梯度（对数型）：常用等密度区带离心时，提高较低密度颗粒组分的分辨率。,凸形梯度（指数型）：常用等密度区带离心时，提高较高密度颗粒组分的分辨率。,复合型梯度：包含上述一个以上的梯度形状，一次离心即可彻底分离样品组分。,3、梯度的形状,4、梯度的容量：指在达到分离要求前提下，梯度介质容纳样品的最大数量。与样品组成，分离要求有关；与梯度总体积、斜率、介质粘度有关；与转速、转子形式有关；差速区带离心时，与样品体积、浓度有关。,5、密度梯度的制备（手工、梯度混合仪、离心形成法）,预形成梯度：手工法、梯度混合仪法,此方法要事先制
21、备密度梯度，常用的梯度介质主要是非离子型的化合物(如蔗糖、甘油等)。离心时把样品铺放在梯度介质的液面上，这个密度包括了所需要研究的密度范围，直到粒子的漂浮密度和梯度的密度相等时，粒子才发生沉降，并排列成不同的区带。,用这一技术可以定量的从线粒体和过氧化物酶体中分离溶酶体。,(1)阶梯梯度：用手工由底部向上分层加入渐浓的介质溶液，由于扩散作用可自然形成连续梯度。扩散时间还受温度、阶梯厚度、阶梯密度差的影响。(2)混合梯度法：借助梯度混合仪或自动梯度仪，可自动调节梯度斜率、形状、浓度，还可同时制备几个梯度。制成的梯度放置过久，梯度形状、斜率会变化。,梯度混合器,三种梯度形成示意图a 线性梯度 b
22、凸形梯度 c 凹形梯度,High density solution,Low density solution,自形成梯度：（3）离心平衡法,自形成梯度的等密度离心(平衡等密度离心)。平衡等密度离心常用的梯度介质有离子型盐类如铅盐或铷盐和三碘化苯衍生物等。离心时是把密度均一的介质溶液和样品混合后装入离心管中，通过离心自形成梯度，让粒子在梯度中进行再分配。离心达到平衡后，不同密度的粒子在梯度中各自分配到其等密度点的特定位置上，形成不同的区带。,四、离心操作(一)加样和离心：1.样品准备：离心前先除去样品中大颗粒和胶状不溶物。要求样液密度梯度最大值（速度区带离心）。样液中含有低浓度盐（如0.2M N
23、aCl）可消除组分颗粒间电荷影响（减慢速度降低分辨率）。样品中需加缓冲剂或保护剂，如酶底物、EDTA等或Ca2+、Mg2+离子。,2.加样：顶部加样沉降差速区带离心；底部加样漂浮差速区带离心；中部加样平衡等密度离心（等密度区带离心）；混合加样平衡等密度离心；差速区带离心：样品须少（5%梯度总体积），样品不太浓（90%梯度最小浓度）。,严格按使用说明操作。样品管要充满且配平；超离心须在低温、真空下进行；加速、减速须缓慢；防止扰动梯度和区带，降低分辨率；平衡等密度离心时，转速不能过高。,3.离心：,(二)梯度的回收,1.底部收集法（穿刺法）：用一根金属空心针从离心管底刺人管内，不同区带内的组分自下
24、而上地先后从针管内分别流出，然后用部分收集器分别收集。从高密度开始收集。,2.顶部收集法：不破坏离心管。取代法：向上取代法：注入高密度液体；向下取代法：注入低密度液体。虹吸法：靠负压依次吸取梯度液。,3.切割法：粘度大时上述方法不适用。冻结切割法；聚合切割法。,(三）梯度分析:测定梯度浓度意义 梯度测定法 样品测定（四）离心制备的步骤:组织-匀浆-过滤-分级离心-梯度离心（五）制备超离心注意事项:注意平衡 查阅目的物信息,超离心设备,美国BECKMAN（J6系列）,超高速离心机,离心操作的注意事项,高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺
25、乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。超速冷冻离心机:未经过培训和考核者不能使用。其它普通离心机：按照操作要求进行。,1.使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。2.离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。3.若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。,4.装载溶液时，要根据各种离心机的具
26、体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。,5.离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。6.每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。7.离心时不准开盖，不准用手停止转头。,The End,
