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1、正向间接血凝试验,省疫控中心周迎春,主要内容,背景原理实验器材的优化试剂的优化样品的优化实验过程优化判定标准注意问题,一、背景,正向间接血凝试验(IHA)是上世纪 60 年代在我国发展起来的血清学诊断技术，是一种用已知抗原检测未知抗体的试验方法，它的操作方法相对简单，实验原理也易于理解，在基层实验条件和技术相对落后的情况下经常被应用到，在一些动物疫病的免疫抗体检测、疫病诊断上具有现实意义。林琳等研究表明应用猪瘟正向间接血凝法(IHA)与斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA）以及猪瘟抗体免凝金标试纸条比较，对规模化养猪场 138份不同阶段猪血清进行检测，三种方法检测抗体的阳性率结果接近。,一
2、、背景,数十年来正向间接血凝试验技术不断完善，它具有简单、经济、快速、实用的特点，在我国有很大的用户群，近年来，兰州兽医研究所生产的液体猪瘟和口蹄疫正向间接血凝试验的试剂用量在逐年加大。然而，正向间接血凝作为一种微量的定量反应试验，实验结果受操作技术影响较大，任何操作环节的纰漏都会使最后判定的结果与正确结论大相径庭。为规范操作，本次培训就实验中器材、试剂、样品、过程和判定标准等方面的优化做一综述，以期作为此实验的借鉴。,二、原理,正向间接血凝试验的原理是将可溶性抗原吸附于与免疫无关的载体（红细胞）表面，此吸附抗原的红细胞与相应的抗体结合，在有电解质存在的适宜条件下发生的肉眼可见的凝集性反应。,
3、二、原理,充分理解正向间接血凝试验的原理，对整个试验的操作和结果判定都具有很大的指导意义。,三、实验器材的优化,本实验所使用的实验器材包括微量血凝板，微量振荡器，移液器和吸头，为保证实验的顺利进行，要选择质量有保障，稳定性好的器材。,三、实验器材的优化,1、微量血凝板实验室经常使用的是有机玻璃材质 或者一次性的110底角的 96 孔 V 型微量血凝板。有机玻璃板板可以叠放，不占实验室台面，处理样品量较大时合适，但每次用完需要清洗。清洗方法：一般先用清水浸泡，然后马上用高压清水冲洗，洗净后用手甩干板子倒置于37温箱中烘干。用前要先检查血凝板孔底是否干净，如发现有透光性差一点的孔，可用酒精棉签擦净
4、。除了有机玻璃板以外，还有一次性血凝板，不需清洗，也不用担心板子不干净影响结果，但不能叠放，测定少量样品适合。,三、实验器材的优化,2、微量振荡器使用振荡器振荡时间不宜超过 10 秒钟，振荡强度不能太大，先从小到大，中等强度即可。多块板叠加后振荡时要用手压住最上一板，以防上下的振动造成孔中液体溅出而影响实验结果的准确性。如果实验室没有它，也可用手轻拍血凝板的边缘即可。,三、实验器材的优化,3、单、多道微量移液器建议使用高质量的移液器，用定量移液器需要准备 50 微升和 25 微升两种。50 微升的用来加稀释液和稀释血清，25 微升的用来加血凝抗原。可调的移液器要选择与检测过程中加样量相近量程的
5、移液器，吸取液体时动作要轻缓，防止溶液吸入过快，冲入移液器污染柱塞或造成堵塞漏气。一定要养成移液器用完后放在移液器架上的习惯，移液器如果掉到地下很容易损坏。用完后移液器用 75%的酒精棉擦拭，并把刻度调到最大值。,三、实验器材的优化,4、吸嘴高质量的吸嘴经过处理后可以重复使用。处理方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂洗，用超声波清洗器处理10分钟，换水后用二层纱布包好，用洗衣机甩干，再用超声波清洗器处理 10 分钟，再用洗衣机甩干，高压消毒灭菌器中 121，20分钟即可，去盖放 37温箱中烘干。吸嘴用完后没有用清水浸泡的很难洗干净，不必重复使用。接触过高感染性材料的吸嘴要高温消毒后废弃。经
6、过处理后的吸嘴如果尖头变弯，则质量不好，不要重复使用。,四、试剂的优化,1、抗原液体正向血凝抗原摇匀后呈咖啡色，无块状物沉淀，静置后血球逐渐沉入瓶底。摇匀后能很快形成均匀混悬液的是好抗原，摇匀后仍有小块黑色沉淀物（血球团）的抗原建议不要使用。如果只做筛检看是否达到合格线，一瓶抗原可以检测 30 到 50 份血清。值得一提的是液体正向血凝抗原 48保存，保存期3个月，不能冷冻保存。,四、试剂的优化,2、对照血清阴性对照血清呈淡黄色清亮液体，阳性对照血清微红或淡黄色略微混浊的液体。阴阳性对照血清可在-15到-20保存，有效期 1 年。3、稀释液稀释液无色透明，一般情况 48保存。用前建议将稀释液放
7、 室温或37温箱中半小时后摇匀再用较好。试剂不能放置太久，最好新进现用。,五、样品血清的优化,新分离血清尽快检测完，未检血清-20保存。冷冻血清待检时需融化，同时避免血清反复冻融影响检测结果。严重溶血、严重污染、腐败或有悬浮杂质的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。,六、实验过程优化,正向血凝实验过程包括：加稀释液，稀释待检血清，稀释阴性、阳性血清，加血凝抗原，震荡静置，结果判定。在试验中要注意以下的问题：1、加稀释液在血凝板上16 排的 19 孔；第 7 排的 14孔，第6-7孔；第 8 排的 112 孔各加稀释液 50 微升。,六、实验过程优化,2、稀释待检血清取1号待检血清 50 微
8、升加入第 1 排第 1 孔，并将枪头插入孔底，混匀后，从该孔吸取 50 微升移入第 2 孔，混匀后从该孔吸取 50 微升移入第 3 孔直至第 9 孔。此时第 1 排 19 孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为 12、14、181256、1512。每个待检血清样品均按上述方法稀释，每稀释一份血清要换吸嘴。每次滴加样本后应吸取稀释液并冲洗几次，最后将滴头内的残液完全排尽，以尽可能的保证样品被全部加入反应孔。作倍比稀释前，应且记将滴头内的空气排尽，避免稀释时孔内产生气泡，直接影响结果判定。,六、实验过程优化,3、稀释阴性对照血清在血凝板上的第 7 排第 1 孔加阴性血清 50 微升，对倍稀释至第4
9、孔。此时阴性血清的稀释倍数依次为 12、14、18、116。第 6-7孔为稀释液对照孔。,六、实验过程优化,4、稀释阳性对照血清在血凝板上的第 8 排第 1 孔加阳性血清 50 微升，对倍稀释至第 12 孔。此时阳性血清的稀释倍数依次为 12、14、1812048、14096。每次试验要做阴阳性对照，最好也做二孔空白对照，即孔中加 50 微升稀释液后加25 微升抗原。每次检测时阴性、阳性和稀释液对照只需各做一份。,六、实验过程优化,5、加血凝抗原被检血清各孔、阴性对照各孔、阳性对照各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原 25 微升。血凝抗原用前要充分摇匀，瓶底应无血球沉淀。一次实验过程应选择同一批号
10、的抗原，并先从稀释度高的孔加起，避免滴头和孔内的液体直接接触。,六、实验过程优化,6、振荡混匀将血凝板置于微量振荡器上振荡 10 秒钟，如无振荡器，用手轻轻摇匀即可。然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，以没有血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下或 37下静置 2 小时，判定结果，也可将板置冰箱中冷藏延至次日判定。,七、判定标准,将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清116孔和稀释液对照孔，均应无凝集（血球全部沉于孔底形成边缘整齐的小圆点），或仅出现“+”凝集（血球大部分沉于孔底，边缘稍有少量血球凝集）。阳性对照血清 12 到 1256 各孔（18 孔）应出现“+”到“+”凝集为合格（少量
11、血球沉于孔底，大部分血球凝集）。如图 1 所示，该阳性血清滴度为1512 倍或记为 9log2。,七、判定标准,在对照孔合格的前提下，观察待检血清各孔，以呈现“+”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。因此正确识别“+”的凝集现象是最后结果判定的先决条件。一般的判定方法是将血凝板放在白纸上，在各对照孔符合要求的前提下，从开始出现沉淀的孔观察起，至血球全部沉淀孔，综观这几孔，前后对比血球凝集和沉淀的发展情况，以1/2血球沉淀孔的血清稀释倍数为该份血清的效价。,七、判定标准,附：血凝试验强度,七、判定标准,例如 1 号待检血清15孔呈现“+”到“+”凝集，67 孔呈现“+”凝集，第8孔呈现“+”
12、凝集，第 9 孔不凝集，那么就可判定该份血清的抗体效价为 1128，或者说 7log2。接种口蹄疫和猪瘟疫苗的畜群免疫抗体效价达到132（即 5log2；第 5 孔）呈现“+”凝集为免疫合格。,八、注意问题,1、鉴于有些场猪瘟间接血凝试验的样品与 ELISA 方法相比符合率不一致，不少学者认为是牛病毒性腹泻抗体的干扰导致的，提出了间接血凝方法虽然简单，但不能区分猪瘟抗体与牛病毒性腹泻抗体。在实验中如果遇到这种情况，建议采用猪瘟抗体单抗阻断ELISA 方法进行检测，其结果更可靠些。,八、注意问题,2、血凝板的孵育时间和判定试剂盒要求使用 110底角的血凝板，判读结果时间应在 2 小时后为妥，冬天还可适当长一点，低于 1.5 小时会判断不准。血凝板第 4 孔和第 5 孔的判断是这个试验的关键，判了第 4 孔则该份血清为阴性，判了第 5 孔则为阳性，阴阳之差往往就在这一下，不能不引起重视。,谢谢！,
