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1、倒置荧光显微镜操作及注意事项,李玉红,显微镜部件及名称,显微镜机体,明视场(BF)镜检,关键点：从光路中卸下其它形式观察需要的所有光学组件，聚光器调节好（调节聚焦和对中），转动孔径光阑调节好像的清晰度。,1，复位 1）逆时针转动，松开透射照明器中的“聚光器再聚焦指紧螺钉”。2）把“目镜筒转盘”设置到O位。3）把显微镜右侧的“中间放大倍数刻度盘”打到1X。4）逆时针转动，松开显微镜右侧粗微调旋钮后面的“物镜再聚焦定位环”。,2.打开透射照明器 1）把电源后部的“外部开关”打到开的位置。2）把电源“电源开关”打开。（把开关拨至）3）按下显微镜左侧的“照明器开关”接通灯泡。3.调节灯泡亮度保证色彩真
2、实。1）把显微镜左侧的“亮度调节盘”设置成12V100W。2）把透射照明器中的“NCB11滤色片”插入光路中。3）把透射照明器中的“ND4滤色片”插入光路中。4.调节光路 1）把10X物镜转到光路中。2）把显微镜右侧的“光路转换盘”转到1的位置。（100%光到观察口）3）向上推透射照明器上的“视场光阑杆”完全打开视场光阑。4）将系统聚光器上的“孔径光阑杆”转至右侧极限处把“孔径光阑”完全打开。5）转动聚光器调焦旋钮把聚光器调至最低位置。5.明视场观察时对显微镜的调整 1）把“聚光器转盘”转到A位置。,6 调节视度及瞳距 1）将显微镜前部的“摄影取景框转盘”逆时针旋转，使摄影取景框进入光路。2）
3、用左眼对着左侧目镜，转动目镜“屈光度调节环”，使取景框中的双十字线清晰成像。3）用右眼对着右侧目镜，转动目镜“屈光度调节环”，使取景框中的双十字线清晰成像。4）将显微镜前部的“摄影取景框转盘”顺时针旋转，使其退出光路。5）调节目镜瞳距，将两目镜视场所见的影像重合在一起。7.调焦 1）将样品放置载物台中。2）转动同轴粗微调旋钮，将标本对好焦。,8.聚光器中心调节 1）确信10X物镜在光路中。2）将“视场光阑调节杆”降低直到能从目镜看到视场光阑像。3）转动“聚光器调焦钮”升降聚光器，使视场光阑像清晰地成象在标本面上。4）转动两个“聚光器中心调节螺钉”，使视场光阑像在视场中心。5）更换40X物镜。6
4、）调节“视场光阑调节杆”，使视场光阑的象与视场大致相同。7）转动两个“聚光器中心调节螺钉”，使视场光阑像在视场正中。,9.进行观察 1）选择要使用的物镜 2）移动系统聚光器上的“孔径光阑调节杆”，使孔径为物镜数值孔径的 7080%。（“把目镜筒转盘”设到B位置，转动勃氏镜调焦螺钉使其聚焦，当观察到物镜的出瞳和孔径光栏的象时，调节其大小。）3）调节“视场光阑调节杆”使视场光阑像与视场相大致相同。4）把透射照明器里的“ND减光片”进入或退出光路以调节视场亮度。补充说明 如果不需要色温很准确的颜色，可以通过显微镜左侧的“亮度调节盘”，改变灯泡电压来调节亮度。10.更换样品 利用显微镜主体上的“物镜再
5、聚焦定位环”，照明器上的“倾斜装置”，“聚光器再聚焦指紧螺钉，可容易更换样品。11.显微镜操作结束后 1)关闭电源开关(开关拨至O)2)灯室冷却后，把显微镜上的聚乙烯防尘罩盖好。,相差（PH）显微术 关键点：将有ph标记的物镜与物镜相同ph标记的聚光器模块一起送入光路，在进行显微术前，校正(对中)物镜里的相差板及聚光器模块里的环形光阑。,1.用明视场（BF）显微术对样品聚焦。2.相差观察时对显微镜的调整。1)将ph物镜转入光路。2)转动“聚光器转盘”，使其与在光路中的物镜(步骤1中所安置的)具有相同的ph标记。3)向右转动聚光器上的“孔径光阑调节杆”，完全打开孔径光阑。补充说明 如果孔径光阑没
6、有完全打开，光路中的环形光阑将受到限制，影响相差效果。4)提高透射照明器中的“视场光阑调节杆”位置，使视场光阑完全打开。3.对中环形光阑 1)把“目镜筒转盘”设到位置，转动勃氏镜聚焦螺钉，使环形光阑像清晰。2)用六角起子转动聚光器模块中的两个“环形光阑对中螺钉”，使环形光阑像与物镜中的相差板环形像同心。3)把目镜筒转盘位置再转到上。,4.进行观察 1)把聚光器“孔径光阑”完全打开。2)移动透射照明器上的“视场光阑调节杆”，使视场光阑像大小与视场大小接近。3)把透射照明器上的“NCB11 滤色片”从光路中移开，把“GIF滤色片”移进光路。(提高反差)4)可通过把“ND滤色片”移进或移出光路来调节
7、视场亮度。补充说明 如果不需要色温准确的颜色，可以通过显微镜左侧的“亮度调节盘”，改变灯泡电压来调节亮度。5.使用不同放大倍数的物镜进行观察 1)把所需放大倍数的相差物镜移入光路。2)转动“聚光器转盘”，使其与在光路上物镜（步骤 1中所安置的）具有相同的ph标记。3)调节放入光路中的环形光阑中心。(见程序3)6.更换样品 利用使用显微镜主机上的“物镜再聚焦定位环”，透射照明器上的“倾斜”装置及“聚光器再聚焦指紧螺钉”，可容易更换样品。,调焦装置 当使用TE2000-U/时：不要同时反方向转动显微镜左右两侧的调焦钮，否则会导致显微镜损坏。粗动调焦钮达到限定位置后，如果继续向同一方向旋转会引起显微
8、镜故障。请不要旋转过度。旋钮的转动量与物镜的移动量关系如下所示。粗微调焦钮所提供的物镜往复范围为：基准位置上方 7 毫米，下方3毫米。粗微调旋转量 物镜的垂直移动量 微动调焦钮旋转一个刻度 1微米 微动调焦钮旋转一周 0.1微米 粗动调焦钮旋转一周 4.9毫米,聚光器座的转动 拧松聚光器座旋转指紧螺钉，聚光器座就可以转动。此功能主要用于微分干涉显微术时调节偏振方向。当用系统聚光器及无起偏器时(例如进行明场显微术或相差显微术时)，此功能可用来左右移动聚光器转盘位置，为显微操作器或其它系统留下空间。,故障及对策,维护 1.镜头的清洁 不要将灰尘、指纹等留在镜头上。镜头、滤色片上的灰尘将影响视场中的
9、图像。如果镜头变脏，按以下方法进行清洁。将灰尘用软刷刷去，或用纱布轻轻擦掉。如果镜头上有指纹或油脂，可用一块沾有纯酒精（乙醇或甲醇）的柔软清洁的棉布、镜头纸或纱布擦去。当擦物镜上的浸油时，使用石油醚。如果没有石油醚，请用乙醇。但是，因为乙醇的清洁效果没有石油醚效果好，需要重复擦表面。（通常清洁镜头要三到四次。）勿用石油醚清洁目镜筒底部的镜头或目镜筒表面。纯酒精和石油醚均为高度易燃品。因此在使用、保管、搬运过程中应格外小心。操作电源开关或台灯尚热时，勿将它们放在灯泡附近。使用纯酒精时，请遵守厂家提供的使用说明书。,简易操作程序：倒置显微镜中最常用的观察方法就是相差。由于这种方法不要求染色，是观察
10、活细胞和微生物的理想方法。在此提供各种聚光器来满足需要，这种方法提供带有自然背景色的、高对比度的、高清晰度的图像。1.开机。接连电源。打开镜体下端的电控开关。2.使用(1)准备：将待观察对象置于载物台上。旋转三孔转换器，选择较小的物镜。观察，并调节铰链式双目目镜，舒适为宜。(2)调节光源：推拉调节镜体下端的亮度调节器至适宜。通过调节聚光镜下面的光栅来调节光源的大小。(3)调节像距：转三孔转换器，选择合适倍数的物镜；更换并选择合适的目镜；同时调节升降，以消除或减小图像周围的光晕，提高了图像的衬度。(4)观察：通过目镜进行观察结果；调整载物台，选择观察视野。3.关机取下观察对象，推拉光源亮度调节器
11、至最暗。关闭镜体下端的开关，并断开电源。旋转三孔转换器，使物镜镜片置于载物台下侧，防止灰尘的沉降。,相差是倒置显微镜最常用的观察方法。该方法不要求标本染色，用于观察活体细胞和微生物最为理想。相差成像技术提供了带中性背景的明亮、高对比度、高分辨率的图像。尼康采用了“切趾相衬的新技术，减少了成像光晕，从而产生对比度优越、色调范围更广的图像。,荧光：在涉及荧光蛋白质这样的活体细胞显微术中，这种方法不可或缺。尼康独创的消杂光机构最大限度地消除了背景杂光，从而在动态活细胞成像试验中观察发微弱荧光的标本时能产生更高信噪比的图像。,霍夫曼调制相衬(HMC)方法使用尼康的专用物镜和标镜，它将相们梯度转换为光强度变化，使透明的活体标本产生生动、具有三维立体感的图像。HMC成像技术中，标本可以置于塑料培养皿中观察，弥补了诺马斯基微分干涉相衬技术的不足。,微分干涉相衬(DIC)方法让未经染色的活体细胞和微生物所观察到的图像具有三维浮雕状的立体感，且对比度和灵敏度出众。尼康DIC系统采用塞拿蒙方法，使用该系统时，您只需转动聚光器顶部的偏振器即可轻松微调图像的对比度。聚光器上的DIC棱镜与物镜上的DIC棱镜一一对应，因此性能得以优化。若将DIC与落射荧光照明组合使用，可以对荧光标记结构或蛋质精确定位，在同一标本里显示细胞形态。,Thanks,
