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1、细菌的鉴定与检测细菌遗传学与基因工程医学细菌学微生物工程,细菌的鉴定与检测,1.活菌检测2.免疫吸附分离法3.噬菌体检验,第一节 植物病原细菌检疫检验技术,1、活菌检测,分离培养法：营养培养基、选择培养基或鉴别培养基分离纯化得到的细菌。浓缩接种及离体叶检测：提取液浓缩接种感病植物，观测发病情况。例如：在1灭菌水琼脂中加75106的苯并咪唑，做平板，加感病植物叶片，针刺摩擦接种，培养（光、温、湿度），短期获得症状。如水稻细菌性条斑病菌和小麦细菌性黑颖病菌的检测。,a,b,c,d,e,24 hpi 36 hpi 72h pi 96 hpi 132 hpi,水稻细菌性条斑病菌接种水稻叶片,Wheat
2、 bacterial black Chaff,Selective medium,在培养基中加入某种化学物质，使之抑制某些细菌生长，而有利于另一些细菌生长，从而将后者从混杂的标本中分离出来,differential medium,利用各种细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，一般不加抑菌剂，观察细菌在其中生长后对底物的作用如何，从而鉴别细菌。如常用的糖发酵管、三糖铁培养基、伊红-美蓝琼脂等。,Stewarts bacterial wilt of corn,Xanthomonasstewartii(Smith)Dowson,分离鉴定进口玉米枯萎病菌的选择
3、性培养基-黑色素培养基,菌落中心黑色边缘透明、圆形、表面光滑。这一特异性状是其他选择性培养基所没有的，也是与其他细菌区分的重要标志。选用酵母浸膏的主要原因是它含有多种氨基酸、维生素和矿物质营养元素，对玉米枯萎菌生长有促进作用；甘油作碳源是合适的，因为它是很多细菌的不良碳源；牛胆酸钠能够抑制部分革兰氏阳性和阴性细菌，对枯萎菌生长无害；利用枯萎菌耐盐的特点，加大盐的用量，抑制了部分不耐盐的细菌；选用水溶黑色素作培养基成份，主要是使枯萎菌吸收黑色素，形成独特的特异性状，便于区分不同细菌。选择性较高、菌落容易辨认、抑制真菌效果好、平板效率较高。,Iron sulphite agar for therm
4、ophilic anaerobe detection铁亚硫酸盐琼脂对嗜热厌氧菌检测,enterobacteria enrichment broth mossel肠道菌增菌肉汤培养基,selective medium for the isolation of enteric pathogens particularly Salmonella and Shigella species.肠道致病菌：沙门氏菌和志贺菌属,Culture media Selective isolation Clostridium perfringens TSC agar选择性分离产气荚膜梭菌,differential m
5、edium,Blood agar is a common differential culture medium used to identify bacteria that causes haemolysis溶血in blood.,Culture media Selective isolation Enterobacter sakazakii选择性分离阪崎肠杆菌,OxoidBrillianceE.coli/coliform Selective Agar now allows improved confirmation of E.coli directly on culture plate,S
6、almonella Growing On XLD Agar沙门氏菌,2.免疫吸附分离法,原理：结合血清学与平板分离技术，利用与抗原高度亲和性的抗体，来捕获目标细菌，样本中其他细菌均被冲洗掉，再将目标细菌转移或释放到培养基上生长。方法：平皿免疫吸附评价测定法和免疫吸附稀释培养法,细菌细胞表面具有蛋白质、脂多糖（LPS）和胞外多糖等抗原分子，利用多克隆抗血清可以鉴定细菌的种。杂交瘤技术的发展为单克隆抗体（MAbs）的制备提供了方向；该技术很快被用于制备病原细菌的单克隆抗体，进行病菌特异性和流行学研究。包括凝集检验（agglutination assays）、ELISA、Western blot、免
7、疫荧光（immunofluorescence，IF）或免疫荧光菌落染色（immunofluorescence colony-staining，IFC）以及侧流方法（lateral flow devices）在内的单克隆抗体和多克隆抗血清对多种形式的检测应用是有效的。,2.免疫吸附分离法,凝集检验：,凝集检验：人畜共患病之布氏杆菌凝集试验：待测血清中抗布氏杆菌抗体与胶乳试剂相遇，发生抗原-抗体反应，出现肉眼可见的凝集反应。试剂：羊、牛、猪三型诊断菌液。操作方法：待检血清（用生理盐水作125、150、l100、1200、1400、l800倍稀释）0.5ml，分别加诊断菌液0.5ml，混匀。37水浴
8、1620h观察结果。标准：非流行区凝集效价一般大于1:80有诊断意义;流行区和牧民区凝集效价在1:160以上才有诊断意义,ELISA：多数病原细菌MAbs的制备开始都是通过 ELISA方法筛选的，然后再用其它免疫诊断检测验证(用于番茄溃疡病菌（C.michiganensis subsp.michiganensis）和番茄细菌性斑点病菌（X.axonopodis pv.vesicatoria）的检测),ELISA,1971年Engvall和Perlmann发表的酶联免疫吸附剂测定enzyme linked immunosorbent assay原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免
9、疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。,共轭,包被,加样,加酶标抗体,加底物液显色,终止反应,结果判定,免疫荧光（IF）抗体法：将荧光染料（异硫氢酸荧光黄或罗丹明）与抗体以化学方法接合，再与抗原反应，形成有荧光标记的抗体抗原复合物，在荧光显微镜下，可观察到黄绿色荧光。IF在欧洲被广泛用于种子和繁殖材料中病原细菌的检测。(荷兰-马铃薯褐腐病的青枯菌（R.
10、solanancearum）法国-马铃薯环腐棒形细菌（C.michiganensis subsp.sepedonicus）;番茄种子中的细菌性溃疡病菌（C.michiganensis subsp.michiganensis）),免疫荧光（IF）抗体法,直接法：用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合。本法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少缺点是敏感度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。,免疫荧光（IF）抗体法,间接法：有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。本法灵敏度高，而且在不同抗原的检测中只需应用一种荧光
11、抗体。,免疫荧光（IF）抗体法,补体结合法本法：是间接法的第一步抗原抗体反应时加入补体（多用豚鼠补体），再用荧光标记的抗补体抗体进行示踪。本法敏感度高，且只需一种抗体。但易出现非特异性染色，加之补体不稳定，每次需采新鲜血清，操作复杂，因此较少应用。,免疫荧光（IF）抗体法,标记法：本法用fitc及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。,流式细胞光度术（Flow cytometer）：用EPICSELITE型流式细胞仪等设置激光波长488nm、输出功率等参数进行检测。用于检测引起花烛疫病（anthurium blight）的
12、X.axonopodis pv.dieffenbachiae，检测油菜（Brassica sp.）的种子提取物中的 X.campestris pv.campetris 以及确定马铃薯种薯中的青枯菌（R.solanacearum）等；免疫磁性分离（Immunomagnetic separation）利用由特异抗体包被的顺磁聚苯乙烯珠把目标细胞能够从混合液中分离出来，接着进行脱洗，被束缚的细胞可用于PCR，或当它们是活的就可以在选择性培养基上培养出。,免疫磁性分离,3.噬菌体检验,原理：噬菌体侵染细菌，裂解寄主细胞。在液体培养时，会使浑浊的细菌悬浮液变清，在固体平板上培养，则出现许多边缘整齐、透明
13、光亮的噬菌斑。噬菌体具有专化性，利用此特点，可鉴别细菌的种类。,非活菌检测,非活菌检测的方法很多，下表是检测病原细菌常用的一些方法，前9种血清学方法，均属非活菌检测。它们既能用于病原鉴定，又能直接用于病种或病株，甚至是无症感染组织的检测。,常规PCR,Mullis等在1985年创立的PCR方法灵敏、准确、方便、快速，可在短时间内扩增出数百万个特异DNA序列的拷贝。目前研究人员已在检测种子带菌方面应用PCR技术做了大量工作，设计得到了大量相关引物。例如，菜豆晕疫病（Pseudomonas syringae pv.phaseolicola），番茄细菌性溃疡病（CMM）等。多种以PCR为基础的分析方
14、法，比如，以rDNA为模板的PCR：ITS-PCR、tRNA-PCR等都已经出现。,免疫PCR（Immuno-PCR),1992由Sano T.等最早使用将血清学中抗原-抗体反应的特异性与PCR的强特异扩增能力结合起来，可以在短时间内精确的检测某一病原物是否存在。原理是：用一段具体的DNA分子标记抗体，应用此抗体去检测抗原，PCR扩增此段DNA分子，根据扩增产物存在与否判断抗原是否存在。根据反应物的不同，目前可将免疫PCR分为单分析物免疫PCR、多分析物免疫PCR、单引物免疫PCR、和双引物免疫PCR。,免疫磁性分离-PCR（Immunomagnetic Separation and Poly
15、merase Chain Reaction,IMS-PCR）,是磁性微球（magnetic microsphere，MMS）载体表面通过化学或物理方法连接上具有一定免疫活性的物质作为配体而研制成的。IMS-PCR的特点是对目的菌进行了二步检测，一是血清的作用，二是是PCR的作用。在检测西瓜细菌性果斑病的试验中等证明了IMS-PCR的灵敏度比直接PCR高100倍，而且不受PCR抑制因子的影响。,实时PCR,实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR）的出现，成为DNA或RNA检测方法的又一突破性进步。它实现了PCR检测从定性到定量的飞跃，运用
16、由计算机控制的新型、便携设备进行自动化操作，使检测结果更加具有准确性、专一性和可重复性，已开始在医学、生物学和诸多农业科研领域中广泛使用。,实时PCR仪器,Light CyclerTM(Roche Diagnostics公司)RAPID（ruggedize advanced pathogen identification device，Idaho Technologies公司）Smart Cycler TD（Cepheid公司）iCycler iQTM（Bio-Rad公司）MX4000TM（Stratagene公司）Rotor Gene（Corbett Research公司）ABI 7700和
17、Gene Amp 5700（Applied Biosystems公司）大多设备能真正做到在每个循环实时监测荧光、收集数据。RAPID和Smart Cycler则是手提式设备。Smart Cycler TD的设计最为独特，它含有16个由微处理器控制的I-CORE（intelligent cooling-heating optical reaction）模块，可以同时进行16个不同的PCR反应。,ABI 7700型,The portable Smart Cycler TD.,RAPID,ABI7900型,Gene Amp5700,Light Cycler,实时荧光定量PCR的特点,实时PCR与传统
18、PCR相比，有许多优势：1、不需Southern杂交鉴定PCR产物。2、全能性更强，减少了交叉污染的可能性。3、需要的劳动力较少。4、易于操作。5、自动提供引物选择所需的数据。6、快速优化反应条件。7、可以用于多重PCR。,Drive to the field,Remove diseased tissue sample,Drive to the lab,incubate tissue in 50 L water for 20 min.,add 1 L sample to reaction tube,run PCR for 20 min.to get results,实时PCR应用,等使用手提式
19、Smart Cycler SC 系统（Cepheid,Sunnyvale,CA）对西瓜中的西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp.citrulli）、蚕豆中的菜豆假单胞菌（Pseudomonas phaseolicola pv.Phaseolicola）、马铃薯中的青枯菌（Ralstonia solanacearum）进行了快速检测。,实时PCR应用,对于马铃薯青枯病菌（Ralstonia solanacearum）D.E.Stead等人发现用实时PCR技术在马铃薯组织中检测青枯菌生理小种2h仍比较灵敏，针对不同小种或生理小种设计的特异引物/探针组合可以提高反应的专
20、一性。,实时PCR应用,类似地，2000年，Weller等也在检测马铃薯块茎中的青枯菌时借助7700测序系统和TaqMan系统，分别用种的16s探针和生理小种2的特异性探针，成功地检测到了浓度为100CFU/ml的青枯菌纯培养。,M.T.Kingsley设计了0.554Kb SCAR（sequence characterized amplified region）片段，该片段来自于柑橘黄单胞菌（Xanthomonas citri）3213菌株RAPD扩增子，鉴于它的唯一性，可将其作为荧光PCR扩增子的潜在来源。用TaqMan TM对来自全球的36个X.c.菌株进行测定，均呈阳性。而其他12种异
21、源DNA则呈阴性。,N.W.Schaad等人首次将实时荧光PCR应用到皮尔斯葡萄叶烧病病菌（Xylella fastidiosa）的快速检测当中，直接以不显症的树藤作为样本，克服了在发病初期不易发现和分离该菌的困难，并详细介绍了该菌的特异探针、引物及反应条件的设计方法，具有较高的参考价值。,第三节 植物病害鉴定与检测实例,Fire blight of pearStewarts bacterial wilt of cornCitrus HuanglongbingCoconut Lethal Yellowing,梨火疫病Fire blight of pear,1878年首先由Burrill描述，在
22、纽约发生，后由Erwin命名，是第一个被确定的植物细菌病害。主要分布于北美洲于西北欧，中欧、地中海、东南欧及大洋州和亚洲也有分布。大约40多个国家。,梨火疫病的地理分布,寄主：梨火疫病菌寄主范围很广，能为害梨、苹果、山楂、木旬子、李等40多个属220多种植物，大部分属蔷薇科危害性：仁果类果树的一种毁灭性病害。一棵多年生的梨和苹果树发病后可在几星期内死亡。,症状：侵害花、果实、枝条和叶片。花：侵染后变深褐色，枯萎。叶片：从叶缘沿叶脉扩展，先呈水浸状，后黑褐色。嫩稍：先水浸状，后褐色至黑色，向下弯曲，呈鱼钩状。果实：病部褐色凹陷，扩展到全果，潮湿时病部生粘稠的细菌溢，初乳白色，后红褐色。病枝：叶片
23、凋萎，幼果僵化，但病叶病果不脱落，远望似火烧状，故称火疫病。伤口：初期水浸状，后下陷，呈溃疡斑，病健交界处产生龟裂纹，韧皮部红褐色，有黏液状菌脓。严重时，病害从嫩稍很快扩展到枝条、主干，直至根部，全株死亡。,Pear fire blight,Erwinia amylovora,Advanced fire blight on fruit-note bacterial ooze on fruit.,主要鉴定特征：梨火疫病最典型的症状是花、果实和叶片受火疫病菌侵害后，很快变黑褐色枯萎，犹如火烧一般，但仍挂在树上不落，故此得名。目前国际上将其症状据受侵害的部位，分成个阶段。,（1）花枯萎：侵染开放的花
24、引起花枯萎。一般发生于早春，病菌直接从花器侵入，初为水渍状斑，花基部或花柄暗色，不久萎蔫。,（2）溃疡枯萎：是指前一季越冬溃疡边缘的病菌重新复活的结果。,（3）枝枯萎：细菌直接侵入前 13叶的枝尖，然后杀死整个枝条及支持枝。,（4）病菌亦可直接从气孔、水孔等自然孔口或蕾苞，或由风引起的伤口侵入叶片，初叶边坏死，并向中脉、中柄、茎扩展，后变黑，通常有菌脓。（5）损伤枯萎和砧木枯萎：前者主要是由于晚霜、冰雹或大风损伤引起，如果实 很容易引起果实枯萎。后者仅限于高感品种EMAL-26、EMLA-9和MARK-39砧木。通常是由感病的接穗在这些砧木上发病后引起，最终成溃疡带而杀死树体。,病原菌：学名：
25、Erwinia amylovora（Burrill）Winslow 异名：Micrococcus amylovorus Burril Bacillus amylovorus(Burrill)Trevisan Bacterium amylovorus(Burrill)Chester 分类地位：原核生物界(Procaryotes),薄壁菌门(Gracilicutes),肠杆菌科(Enterobacteriaceae)欧文氏菌属(Erwinia)解淀粉欧文氏菌,形态特征：直杆菌，有荚膜，周生鞭毛，能运动，大小为0.9-1.8 0.6-1.5m，多数单生，有时成双或短时间内3-4个呈链状。革兰氏染色阴
26、性。在蔗糖培养基上27下培养3d，菌落直径34mm，白色至奶油色，半球形隆起，有黏性，表面光滑，边缘整齐，中心绒环状。,生物学特性：兼性厌氧，过氧化物酶阳性，氧化酶阴性，好气条件下利用葡萄糖产酸不产气，厌氧条件产酸缓慢。明胶碟形液化缓慢。不产生硫化氢，不利用丙二酸盐。葡萄糖酸盐氧化和七叶苷水解不稳定。氯化钠浓度高于2以上时生长延缓，至67%时则完全抑制。抗青霉素，对氯霉素、链霉素和土霉素敏感。细菌生长的温度范围637，最适温度2527.5，致死温度4550，10 min，最适酸碱度为pH6.0。,梨火疫病菌以简单的细胞分裂繁殖，一个细胞在条件适宜时，天内在寄主植物组织中能达到109细胞，每个细
27、胞都是一个侵染源，感染寄主而引起病害的发展。除蛋白酶外，病菌不产任何有助于侵入寄主的酶，主要是在环境条件适宜时，通过胞间组织侵入薄壁组织的病菌产生胞外多糖。胞外多糖在病害发展过程中起重要的作用，其是菌脓的重要成份。菌脓的理化性质随湿度变化而变化，干时皱、硬，大时膨胀易被雨水扩散，中等湿度的菌脓粘易被昆虫、风传播。,发病规律：病菌在病株病疤边缘组织处越冬，挂在树上的病果也是越冬场所，如果冬季温和，病菌还能在病株树皮上度过，来年早春病菌在上年的溃疡处迅速繁殖，遇到潮湿、温和的天气，从病部渗出大量乳白色粘稠状的细菌分泌物，即为当年的初侵染源，通过昆虫、雨滴、风、鸟类以及人的田间操作将病菌传给健株。病
28、菌亦通过伤口、自然孔口（气孔、蜜腺、水孔）、花侵入寄主组织，有一定损伤的花、叶、幼果和茂盛的嫩枝最易感病。,传播途径近距离传播：雨水是果园短距离传播的主要因子，其次风亦是中短距离传播的重要因子，往往在沿着盛行风的方向，病原菌被风携带到较远距离。除次之外，昆虫对病菌的传播扩散起一定的作用。传病昆虫包括蜜蜂在内有77个属的100多种昆虫，其中密蜂的传病距离约为200 400 m。远距离传播：主要是感病寄主繁殖材料，包括种苗、接穗、砧木、水果、被污染的运输工具、候鸟等。,梨火疫病的远距离传播,发生条件：受伤的花朵、幼果和嫩稍最易受病菌侵染。经冰雹袭击，病害蔓延更加迅速。较高气温（1824）和较高的湿
29、度（70以上）有利于病菌侵染。,检验方法：1.产地检验：2.症状观察：梨火疫病的症状很典型，是鉴定的重要方法，但必须与其他症状相似的梨梢枯病区分开。梨梢枯病仅限于危害花器、叶片和嫩梢，不危害枝条和茎干，病部无细菌溢脓，叶片上最初为深褐色斑点，周围有红色晕圈，枯死的病叶不会长期挂在树上,3.分离培养可采用选择性培养基和鉴别性培养基进行。MS培养基菌落为红橙色，背景为兰绿色。配方：琼脂20g，甘露醇10g，L-天门冬酰胺3g，牛胆酸钠2.5g，磷酸氢二钾2.0g，烟酸0.5g，MgSO47H2O0.2g，次氮基三乙酸0.2g，硫酸十七烷基钠0.1ml，0.5%溴麝香草酚兰水溶液9ml，0.5%中性
30、红2.5ml，蒸馏水970ml，pH7.3灭菌后加1%放线菌酮5ml，1%硝酸铯水溶液1.75ml。CG培养基在29培养48小时后形成典型的火山口状菌落。配方：水380ml，蔗糖160g，营养琼脂12g，结晶紫0.8ml（1%乙醇溶液），0.1%放线菌酮20ml。,TTC培养基：该培养基是Weise(1981)设计的四氮锉-福美联培养基。梨火疫病菌在27培养23天后，可产生红色肉疣状菌落。配方：营养琼脂37g，蔗糖100g，酵母粉5g，葡萄糖15g,水100ml，pH6.87.2。灭菌后加0.5%TTC10ml，福美联85250ml。CCT半选择性培养基：Tshimaru和Kios于1984设
31、计的。梨火疫病菌 28培养48小时后，形成淡紫色透明菌落，中央颜色略深。配方：蔗糖10g；山梨醇10g；1%SDS30ml，0.1%结晶紫乙醇溶液2ml，营养琼脂23g，蒸馏水 970ml。灭菌后加入1%硝酸铯水溶液2ml和放线菌酮0.05g。,Zeller改良高糖培养基：梨火疫病菌在此培养基上27培养23天后，菌落大小为37mm，橙红色半球形，高度凸起，中心色深，有蛋黄状中心环，表面光滑，边缘整齐。配方：牛肉浸膏8g，蔗糖50g，放线菌酮50mg，0.5%溴百里酚兰9ml，0.5%中性红2.5ml，琼脂20g，水1000ml，pH7.4。,4.致病性实验梨火疫病菌致病性试验可用梨片或梨嫩枝测
32、定，亦可用烟草过敏反映检查。NA上培养48小时的细菌配成108 cells/ml的悬液，注入烟草叶片或接种于1cm厚梨片、或针刺接种于丈长的枝条，28下培养，一般1012小时后，烟草注射区出现白色坏死斑。13天后，梨片或枝条上出现白色菌脓，则可确诊。5.血清学检验：免疫荧光、ELISA、ODD和凝集实验6.分子生物学方法：核酸探针和PCR技术,玉米细菌性枯萎病Stewarts bacterial wilt of corn,分布：1889年纽约首先报道，现已20多个国家。分布于美国、加拿大、墨西哥、越南、泰国、马来西亚、前苏联、波兰、瑞士、意大利、前南斯拉夫、罗马尼亚、希腊、哥斯达黎加、波多黎各
33、、圭亚那、秘鲁、巴西。,寄主植物 主要是甜玉米，也侵染马齿玉米、粉质玉米、硬粒玉米和爆裂玉米。危害：维管束病害、毁灭性病害。,症状：整个生育期都可危害，以开花期症状最明显。早期症状表现为植株矮化，萎蔫，雄穗退色早枯，叶片边缘产生波纹状不规则病斑。初期水浸状，黄色，与叶脉平行，贯穿全叶，宽110mm，严重时病叶萎蔫死亡。生长后期，叶片产生许多小病斑，结合成大块，火烧状干枯死亡。髓部有空腔，导管被黄色黏液阻塞，萎蔫植株的下部切口有黄色细菌溢脓。果穗的菌脓可通过内层包叶的气孔渗出，籽粒表面沾满细菌菌脓，病籽粒变形、皱缩和变色。,Necrotic lesions on mature leaves;se
34、cond phase of Stewarts wilt disease.,病原菌：玉米细菌性枯萎病菌 学名 Pantoea stewartii(Smith)Mertaert et al.异名 Erwinia stewartii(Smith)Dye；Pseudomonas stewartii Smith;Apalnobacter stewartii(Smith)McCulloch;Bacillus stewartii(Smith)Holland;Bacterium stewartii(Smith)Smith;Phytomonas stewartii(Smith)Bergye et al;Pseu
35、dobacterium stewartii(Smith)Hrasilnikov,1949;Xanthomomas stewartii(Smith)Dowson英文名 Stewarts bacterial wilt of corn 分类地位 原核生物界(Procaryoces)，薄壁菌门(Gracilicutes)，肠杆菌科(Enterobacteri-aceae)，泛菌属(Pantoea),形态特征：好气性短杆菌，两端钝圆，无鞭毛，有荚膜，G，单生或双生，0.40.80.92.2。在牛肉膏培养基上形成黄色圆形菌落，全缘，表面扁平光滑，能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、木糖、甘油鹤甘露糖
36、、醇等产酸，但不产生气体。在肉汤培养液中生长微弱，形成灰色环和黄色沉淀物。细菌生长温度最低温度89，最适温度30，最高温度39，致死温度53 10min，适宜pH4.58.5，最适6.08.0。,发病规律：初侵染来源带菌的种子和昆虫。土壤和病原残体不能越冬，昆虫是病原细菌的传播介体和重要的越冬场所。最重要的传病昆虫是玉米叶甲，它以成虫带菌越冬，细菌存在于消化道中。越冬后在早播玉米苗上取食，引起初侵染，并产卵发育成新一代成虫，继续向其它植株传病。,Corn flea beetle(Chatocnema pulicaria)vector of the Stewarts wilt bacterium
37、(Pantoea stewartii).,流行条件：发病与流行主要决定于冬季气温（12、1、2月）的高低，若平均气温总和在37以上，有利虫媒越冬，带菌昆虫成活率高，有可能引起发病。低于32则很少流行。此外有利于发病的条件包括土壤氮肥水平偏高，钾肥水平偏低，高温高湿等。,检验方法：产地检验：种植检验：种子长出的植株有明显的症状。3.分离培养：采用伊凡诺夫选择培养基，其成分如下：甘油30ml 柠檬酸铁铵10g 磷酸氢二钾2.5g,氯化钠15g硫酸镁0.1g,琼脂17g 氯化钙0.1g,蒸馏水1000ml,pH7.0 为了抑制杂菌的污染,还可采用选择性黑色素培养基,其成分如下:酵母浸膏 1g 甘油
38、30ml 制霉菌素 200mg/ml牛胆酸钠 3g 氯化钠 15g 1%水溶性黑色素20ml琼脂 17g 蒸馏水 1000ml pH6.730下培养7d，对光观察，菌落中心呈黑色，边缘透明，菌落圆形，表面光滑，呈粘状。将分离的细菌接种在玉米苗上，验证是否发病。,4.噬菌体检验法：用专化性噬菌体，如ZP6、ZP82等检验。5.血清学检验：用酶联免疫法等检验。检疫和防治1.禁止从国外疫区进口玉米种子2.种子处理：（1）微波炉70处理10min，效果很好。（2）环氧乙烷熏蒸：（3）恒温处理：50下处理4d，消灭种子内部细菌效果显著，不影响发芽。（4）抗菌素温浸法：3.防治传播媒介昆虫：4.种植抗病品
39、种：,柑橘黄龙病Citrus Yellow shoot,Huanglongbing,分布：1939年在中国广东发现该病，现已扩展到亚洲和非洲40多个国家和地区，中国主要发生在广东、广西、福建、台湾、海南、云南、贵州、四川、浙江、湖南、江西等省。寄主：主要是柑橘属、金柑属和枳属。草本植物有长春花。,？,危害：是柑橘的毁灭性病害，感病的柑桔品种得病后可在35年内丧失结果能力，甚至枯死。症状：典型症状是在浓绿的树冠中出现12条或多条的发黄枝梢，有两种类型：一种是整张叶片均匀黄化，另一种是叶片呈黄绿相间的斑驳状。共同特点是叶质硬化、无光泽，但在黄梢下部的老叶仍呈正常绿色。病果小，果皮光滑，畸形，无光泽
40、，味酸，果皮着色时黄绿不均匀或在果蒂附近变橙红色，而其余部份仍为青绿色的青果,叶：老叶斑驳，新叶缺素状；果：“红鼻果”、“青果”,病原Candidatus Liberibacter asiaticus（亚洲种）、Candidatus Liberibacter africanus（非洲种）、Candidatus Liberibacter americanus（美洲种）分类地位：原核生物界(Procaryoces)，薄壁菌门(Gracilicutes)，韧皮部杆菌属 Liberobacter英文名称：Citrus Huanglongbing；Citrus Yellow shoot；Citrus g
41、reening,未能在人工培养基上分离获得纯培养，在电镜下为椭圆形或短杆状的细菌，大小为306005001400m，细胞壁厚度为2530 m。革兰氏染色阴性，对四环素及青霉素敏感。根据其对热的反应和传病木虱的不同，分为两个株系：在亚洲，其发病的最适温度为2732，传播介体为亚洲木虱（Diaphorina citri），病原为柑桔黄龙病原亚洲株系（L.asiaticum）；在非洲，其发病的最适温度为2024,传播介体为非洲木虱（Trioza aryteae）病原为柑橘黄龙病非洲株系（L.africanum）。可以通过嫁接及菟丝子传播，但不能通过汁液和土壤传播。,传播：远距离传播主要是来自病区调运
42、的苗木、接穗；大田主要依靠柑橘木虱进行传播，在亚洲是亚洲木虱，在非洲是非洲木虱。发生条件：亚洲多发生在热带亚热带地区，喜高温；在非洲多在冷凉气候下发生，30以上高温病害受抑制。,检验与检测：1.产地检验：每年1012月症状表现最明显2.生物学诊断：鉴别寄主法3.电镜检查：4.荧光显微镜检查：黄色荧光5.化学诊断：染色法6.血清学检测：7.分子生物学方法,检疫与防治：1、实行检疫 禁止病区苗木及一切带病材料进入新区和无病区，新开辟的果园要种植无病苗。2、建立无病苗圃对优良单株进行脱毒并经鉴定证明不带菌；在网室内建立种质圃；在隔离地方或在网室内建立无病母本园；在隔离地方或在网室内建立无病苗圃。3、
43、挖除病株4、防治柑桔木虱。5.加强栽培管理,查文献，列出huanglongbing的检测方法要求：列出参考文献,例如：1.Real time PCR（目的基因为）Author 1,Author 2,Author 3.Title title title title title.Jounal,year,vol,page-page.2,课程作业,椰子致死黄化病 Coconut Lethal Yellowing,名称来源于Nutman and Roberts(1955)。他们首次用致死黄化（lethal yellowing）命名在加勒比海、牙买加西部地区发生的一种椰子致死黄化型的毁灭性病害。该病害在加
44、勒比海地区至少已有100年的历史，在西非也有50年的历史。目前分布在拉丁美洲开曼群岛、巴哈马群岛、古巴、多半尼加、海地，非洲和西印度群岛，亚洲的印度尼西亚、辛都、马来西亚、美国佛罗里达洲南部地区等地也有报道。,寄主范围：除为害椰子树(Cocos nucifera L.)外，还可以为害油棕、枣椰子、扇棕、马尼拉棕、海棕等30多种棕榈科植物。大部分椰子品种抗病性差，在棕榈科的15个主要类群中，至少有7个是感病的。感病寄主属包括：Allagoptera，桄榔属 Arenga，Arikuryroba，Boraxxus，鱼尾属Caryota，散尾属Chrysalidocarpus，椰子属Cocos，Co
45、rypha，Dictyosperma，Gaussia，Hyophorbe，Latania，薄葵属Livistona，Mascarena，Nannorrhops，刺葵属Phoenix，Pritchardia，棕榈属Trachycrpus，Veitchia。,危害情况:是椰子和棕榈科植物的毁灭性病害。在牙买加，据统计1961年的600万株感病的Jamaica Tall椰子中的90在1981年因感染黄化植原体而死亡。在加纳，在过去的30年中，已有约100万株椰子因感病而死亡；在多哥，截至1964年，约60000株或50的椰子树因感病而死亡；在Florida，到1973年，至少20000株(约6)的椰
46、子树感病。在墨西哥和坦桑尼亚，成千上万公顷的椰子已被病害侵袭而死亡。,症状：各龄椰子树均可感病。病害早期的典型症状是花序干枯。开始时顶部复叶有褐色枯死斑，可深入到裹在里边的羽状叶，再向深处扩展，最后致死生长点，未成熟的果实脱落。开花的花序轴从顶端开始坏死、变黑，佛焰苞未成熟就提前开放，然后凋萎、落花、落果。以后叶片开始黄化，下层的叶片迅速发展到主株叶片，直至脱落。芽片感染后表现有不规则的褐色水浸状条斑，逐渐发展到芽腐，并有恶臭味。此时新叶很容易被剥离掉。在叶部呈现黄化症状时，根系出现坏死，不久腐烂，根系受害死亡。,总之,叶片黄化症状是植原体侵入根系后导致生理学、生物化学变化的结果。一般椰子黄化
47、植原体病症状发展过程如下：大多数感病植株在果实成熟前提前落果新开的花序黑化从下部叶片到上部叶片逐渐黄化针形叶死亡和脱落，可能仅保留少量绿叶整个树冠脱落，仅留赤裸的呈线杆状枝干,病原：椰子致死黄化植原体 学名 Coconut lethal yellowing Phytoplasma英文名 Coconut lethal yellowing 分类地位 原核生物界，无壁菌门，软球菌纲，植原体属（MLO）,形态特征电镜下，典型的植原体颗粒存在于病株的筛管中。颗粒是卵形、椭圆形、及丝状，由三层结构组成即：两层电子密集层，中间隔一层透明层。在感病椰子树韧皮部筛管细胞内可见植原体的存在，形状包括丝状、念珠状及
48、近球状，大小为400-2000 nm。在新近成熟的韧皮部筛管细胞中常见有植原体，而在薄壁组织中未见植原体存在。,传播途径在自然条件下，椰子致死黄化病的介体为麦蜡蝉（Myndus crudus）。叶蝉（Gypona sp）也有可能是潜在介体。叶蝉介体在美洲的地理分布与病害植原体的分布相吻合。在非洲西部，叶蝉Myndus adiopodoumeensis被怀疑也是一种传播介体。有报道表明化学防治昆虫介体可明显降低病害的传播速度。在国际贸易中带病的植物材料，包括观赏树种，能传带病菌。,检验与检测 1 产地检疫 根据植物受侵染后的症状，鉴定是否感病。2生物学方法 利用介体昆虫麦蜡蝉在可疑的植物上取食后，接种到长春花上，诱发长春花产生植原体病害的典型症状，但潜伏期较长。3电镜观察 用电镜观察植物韧皮部组织中是否有植原体存在。4 核酸杂交和PCR检测技术 Harrison等1992年报道用5种DNA探针可用于椰子和其他棕榈科植物上的椰子致死黄化植原体的检测；Rohde 等1993年报道应用PCR技术成功的检测椰子致死黄化植原体。,检疫措施1、严禁从疫区进口椰子果和苗木。2、严格把关，加强检疫。3、科研单位特殊需要进口，应由检疫机关审批隔离试种一年以上，证明种苗是健康的，方能进口。,Thanks 4 ur attention!,
