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1、革兰染色,一、染色标本的制备,1、涂片：载玻片上滴加生理盐水一滴，接种环取待检菌培养物少许，研入无菌生理盐水中，形成一个极薄的均匀的菌膜，直径在1cm左右为宜。如果时液体培养物则直接取少许菌液涂成菌膜。2、干燥：室温自然干燥即可。也可在远离火焰上方的空气中干燥。切记不可太近火焰，以免烤焦废弃。3、固定：一般用加热法固定。将载玻片迅速来回通过火焰3次，以玻片触及皮肤热而不烫为度。这样可以使菌体粘附于载玻片上。加热还可杀死细菌，改变细菌细胞膜的通透性，易于染色。也可用甲醇、乙醇等化学药品固定。,二、染色的目的与原理,细菌、真菌和其他微生物的细胞质是透明的，不借助染色方法很难观察到这些微生物。染色后
2、有助于细菌的观察与菌种的鉴别。细菌细胞通常带负电荷,简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料与菌体细胞黏附使菌体着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比，更清楚易辨。,三、染色方法,1、单染色法：仅用一种染料对细菌进行染色，操作简单。可观察细菌的形态、大小及排列，但不能显示细菌的结构及染色特性。分为染色、水洗、干燥三个步骤。染色剂为亚甲蓝或碱性复红染色液。,三、染色方法,2、复染色法：用两种或以上的碱性染料先后对细菌进行染色。可观察细菌的形态、大小及排列，能显示细菌的结构及染色特性，还有鉴别细菌的作用。常用革兰染色法。通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）两大类。
3、丹麦细菌学家G.Gram发明而得名。,2.1实验材料：大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌18-24h培养物；草酸铵结晶紫染液；沙黄染液；生理盐水；95%乙醇；卢戈碘液；二甲苯；接种环；酒精灯；显微镜等。,2.2、染色方法：包括初染、媒染、脱色、复染、镜检、结果分析等步骤。初染染料为碱性染料，常用结晶紫。媒染剂的作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。常用碘液。脱色剂帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。常用丙酮或乙醇。复染液也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与
4、未脱色菌进行比较。常用沙黄染液或蕃红花红溶液,2.3、意义：（1）鉴别细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大类,这样可将致病菌的范围缩小,然后再进一步鉴定。(2)选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞壁等结构上有很大差别,因而对抗生素的敏感性不同。例如大多数阳性菌对青霉素敏感大多数阴性菌对青霉素不敏感(脑膜炎球菌等除外),可供临床实践中选用抗菌药物的参考。(3)与致病性的关系:大多数革兰氏阳性菌的致病物质主要为外毒素;而大多数革兰氏阴性菌的致病物质主要为内毒素.,2.4具体操作步骤：涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，从酒精灯外焰穿过，于载玻片中央涂成薄层（事
5、先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。,具体操作步骤：干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动34次，共约34秒。要求玻片温度不超过60，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。,具体操作步骤：2.4.4.染色：（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水
6、洗。（3）脱色：将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒，立即用水冲净酒精。（4）复染：用番红液染12分钟，水洗。（5）镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。,2.5固定的目的 杀死微生物，固定其细胞结构；保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉；改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。,2.6实验现象：染色后菌体呈蓝紫色的，称为“革兰阳性菌”；菌体是伊红色
7、，称“革兰阴性菌”。无论阳性菌还是阴性菌，都有杆菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌是临床最为常见的病原菌。葡萄球菌属于革兰阳性菌，大肠杆菌属于革兰阴性菌。除大肠杆菌以外，临床较常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌属，沙门菌属、克霉白菌属；铜绿假单胞菌是临床常见的较耐药革兰阴性杆菌。,格兰染色Mp4,作业：,1、染色标本的制备方法2、革兰染色的具体步骤3、革兰染色的医学意义,2.7实验原理：细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它溶解，所以染色的前二步结果是一样的，但在G+细胞中，
8、乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘的复合物分子太大，不能通过细胞壁，保持着紫色。在G细胞中，乙醇处理不但破坏了胞壁外膜，还可能损伤肽聚糖层和细胞质膜，于是被乙醇溶解的结晶紫和碘的复合物从细胞中渗漏出来，当再用衬托的染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，红色显示不出来。,细菌结构模式图,2.7实验原理：G+细菌的细胞壁G+细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致密的肽聚糖层，多达20层，占细胞壁成分的60%90%，它同细胞膜的外层紧密相连；有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸。细胞生长中有自溶素（酶类）起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能，阻
9、止胞壁过度降解和壁溶。如果细胞壁的肽聚糖层被消溶，G+细胞成为原生质体（protoplasts），细胞壁不复存在，而只存留细胞膜。除链球菌外，大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质。,2.7实验原理：G+细菌的细胞壁,2.7实验原理 G细菌的细胞壁 G细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄而结构较复杂，分外膜和肽聚糖层。肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来。细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间，称为壁膜间隙。外膜的基本成分是脂多糖（LPS），还含有蛋白质。许多G-细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的，它的毒性组分常称为内毒素,细菌外毒素与内毒素的区别,2.7实验原理：G-细菌的细胞壁,细菌芽孢
10、模式图,细菌生长曲线图,2.8革兰染色的医学意义：1、可以协助鉴定细菌2、为临床使用抗生素提供依据3、有助于了解分析细菌的致病性,2.9影响因素革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。具体有以下因素会影响到染色结果：1操作因素 2细菌因素 3染液因素,操作因素1、涂片太厚 在涂片时细菌挑的太多，没法分开，在脱色时就不能将第一步染上的结晶紫的颜色脱去，可能会使革兰阴性菌也出现紫色，误认为革兰阳性菌。2、脱色时间 阳性菌透性小，不
11、易被脱色，阴性菌透性大，易脱色；但这是在固定的时间条件下的结果，如果延长脱色时间，也会使脱色剂渗透进阳性菌的细胞壁中，使染上的结晶紫脱去颜色，最后染上复红的颜色，变成革兰阴性菌。而脱色时间太短的话又会使阴性菌染上的结晶紫不能完全脱色，出现紫色，误认为革兰阳性菌。3、固定方法 在实际操作中有的同学将玻片在火焰上烤的太久，改变了细菌原有的通透性，会使细菌的染色性发生变化。影响了染色的结果。,细菌因素1、细菌培养时间:细菌的典型形态、染色性是在对数生长期，取这时的细菌做革兰染色可以反应细菌的真实的染色性。如果细菌培养时间太长，变成了老龄菌，染色性就会发生变化，可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。2、培
12、养基的成分:一般认为革兰阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色。但是如果培养基中缺乏核蛋白质镁盐就不能合成菌体成分的核蛋白质镁盐，细菌与碘和结晶紫的复合物结合就不牢固，容易脱色，可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。,染液因素1、碘液：碘液作为媒染剂能增加染料与被染物的亲和力。如果碘液放置时间太长，或经日光照射失效，失去媒染剂的作用，就可能使结晶紫与细菌结合的不牢固，容易被脱色，使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。2、结晶紫：结晶紫的浓度太高，就会使染上的颜色不容易被酒精脱色，可能会使革兰阴性菌染成革兰阳性菌。3、酒精：酒精作为脱色剂，革兰染色的脱色酒精浓度为95%，在此浓度下革兰阳性菌染上的结晶紫不易被脱去，保留紫色，革兰阴性菌染上的结晶紫容易被脱去，最后呈红色。但当酒精的浓度为70%时，它的脱色能力最强，可能使革兰阳性菌染上的结晶紫也被脱去，使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。,作业：,1、革兰染色的实验原理2、革兰染色的影响因素,
