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1、,显微技术(光镜)江苏大学 基础医学与医学技术学院 组织胚胎学系卢小东,Naked EyeLightMicroscopeElectron Microscope,OrganismsOrgansCells(20u)Nucleus(2 u)Bacteria(0.5 u)OrganellesVirusesMacromoleculesAtoms.,Resolving power,分辨率：光镜：0.2 m电镜：0.1nm,显微长度单位millimeter(mm)=10-3 metermicrometer(m)=10-6 meternanometer(nm)=10-9 meter,显微镜技术:光镜：ligh
2、t microscopic,LM电镜：electronic microscopic,EM透射电镜（transmission electron microscope,TEM）：观察细胞内部结构扫描电镜（scanning electron microscope,SEM)：观察组织或细胞表面的立体结构,组织学的研究技术,光学显微镜技术 显微镜17th 18th,光学显微镜技术 显微镜18/19th 19th,Eye Pieces,Objectives,Stage,Light source,Vol.control,On-off Button,Controls,Fine focus control,Co
3、arse focus control,10X4 低倍观察10X10 中倍观察10X40 高倍观察10X100 油镜,普通生物显微镜的放大倍数,光学显微镜原理,荧光显微镜是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布。,相差倒置显微镜是用以观察培养细胞。一般光镜不易分辨无色透明的活细胞，需用相差显微镜（phase contrst microscope）才能观察。相差显微镜可将厚细胞不同或度及细胞内各种结构对光产生的不同折射，转换为光密度差异（明暗差），从而使镜下结果反差明显，影像清晰。,细胞培养,光镜标本制备,？,光学显微镜技术常见标本制备：HE染色，石蜡切片,特点：石蜡切片是使石蜡充分浸入组织，组织块变
4、硬，有利于切薄，制作的切片能完好地保存组织原有的结构，透明度好，并可长期保存，有利于显微镜下观察组织图像。这种方法包括以下几个步骤：,步骤取材固定：福尔马林脱水：酒精透明：二甲苯 包埋：石蜡 切片：切片机 染色：HE,取材 根据教学和科研的具体要求确定材料、部位和方法材料新鲜组织块的大小：使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部。如制作病理外检、科研切片，取0.10.2cm即可勿挤压组织块 保持组织原有形态、保持组织清洁,固定 为了阻止组织细胞的死亡后变化，防止自溶与腐败，保持组织内细胞原有的形态结构，切取组织块后应立即进入固定液，常用的固定方法有：小块组织固定法：标本：固定液为1：420；最常用的
5、方法，但组织块不易过大过厚，最好置入冰箱冷藏室内固定，冷藏固定时间适当延长，特别是组织化学实验用的材料，冷藏固定效果会更好。注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，或需要整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入血管，经血管分支达整个组织和全身，从而得到充分的固定的目的。固定液：单纯固定液（10%甲醛固定液和95%乙醇）混合固定液：酒精-甲醛固定液（95%酒精9份、40%的甲醛1份）；Zenken氏液（重铬酸钾2.5g，升汞5.0g，蒸馏水100ml,冰醋酸5 ml）；Bouin氏液（苦味酸饱和水溶液25 ml,40%甲醛25 ml，冰醋酸
6、5 ml）,脱水与透明 标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，必须将组织块内的水分置换出来，这一过程叫做脱水。脱水的步骤是：80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇2小时，此过程可用脱水机自控完成。丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂，但因其脱水能力很强，对组织有剧烈收缩作用，在制作科研、教学切片时一般不用该试剂。但因其沸点低，脱水力强，加温至沸点时在短时间内可脱水彻底，故病理外检快速石蜡切片时可用丙酮脱水剂。乙醇、丙酮等不溶于石蜡，还要经过一个能溶于石蜡的溶剂替代过程，此过程称为透明。常用的透明剂有二甲苯、三氯甲烷、冬青油等。,Dehydration脱水透明,浸蜡 已透明的组织移入已熔
7、化的石蜡中，使蜡充分浸入组织内，此过程称为浸蜡又称透蜡。浸蜡时应注意以下几点：浸蜡熔点：石蜡分为软石蜡与硬石蜡两种，熔点为4254一般称为软蜡，熔点为5662称为硬蜡。浸蜡时，应先经软蜡再经硬蜡，（常用的浸蜡熔点为5254、5456、5658级浸蜡），使组织中含有的透明剂完全去尽。浸蜡温度：浸蜡的温度应高于熔点的25为宜，温度过高可致组织过度收缩或变脆，如在温箱内浸蜡，要将温度控制在6065的范围。浸蜡时间：可根据组织块的大小及其组织种类而定。30min几小时,包埋：将浸蜡后的组织置于融化石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包在其中，称蜡块，此过程称为包埋。包埋用的石蜡和加温的镊子均不能温度过高，防止
8、组织被烫伤，破坏组织结构。包埋用的石蜡温度应与组织块本身的温度相等，如温度不一，可造成组织与周围石蜡脱裂的现象。包埋所用的石蜡要求无杂质，并有一定的粘韧性。蜡的熔点与组织块相适应，过硬的组织（如骨组织、肌肉组织、皮肤等）可用硬度较高的石蜡包埋。包埋用的石蜡可以重复使用，,Embedding 包埋,切片机石蜡切片机,冰冻切片机,Knife,Microtome Arm,Tissue Block,Section,Microscope Slide,How does a microtome work?,Tissue,切片,on Microtome(wax),on Cryostat(frozen),裱片,
9、冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法：低温恒冷箱冰冻切片法,取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24242mm。取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在510um间。调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调
10、节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10-15左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-1520左右，切带脂肪的组织时，应调至-25左右，切含大量的脂肪时，应调至-30。,冰冻切片,冰冻切片染色 切片固定30秒1分钟。水洗。染苏木素35分钟。分化。于碱水中返蓝20秒。伊红
11、染色1020秒。脱水，透明，中性树胶封固。,涂片,磨片,HE染色,苏木精 Hematoxylin碱性染料被苏木精染成蓝色的特性称嗜碱性Basophilic，如：细胞核，核糖体，粗面内质网等伊红 Eosin酸性染料被伊红染成红色的特性称嗜酸性Acidophilic如：细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、滑面内质网）中性或嫌色性与两染料的亲和力都不强,1、取材2、固定3、漂洗4、脱水5、透明6、透蜡7、包埋8、修块9、切片10、染色,石蜡切片HE染色操作步骤,常规石蜡切片HE染色程序(一)脱蜡至水1二甲苯 5-15分钟2二甲苯 5-15分钟3无水乙醇 3分钟495酒精 3分钟580酒精 3分钟670
12、酒精 3分钟7自来水洗(二)染色1Harris苏木素液 5-7分钟2自来水洗 5分钟31盐酸溶液分化 30秒4自来水洗 5分钟 51氨水返蓝10秒6自来水洗 15-20分钟795酒精 3分钟81伊红酒精溶液1-2分钟,(三)脱水、透明和封固l95酒精2分钟2无水酒精2分钟3无水酒精2分钟4二甲苯5分钟5二甲苯5分钟,染色,manually,automated,HE染色,注意事项任何石蜡切片必须经过二甲苯进行脱蜡后才能染色，石蜡切片要求平板烘干，以便组织与玻片粘贴牢固。组织切片脱蜡的好坏，与二甲苯的温度及时间有关，二甲苯使用时间过长，应及时更换。在HE染色过程中，其成败的关键在于分化，如果分化不
13、当致使应该分化脱色的部分末予脱去，或分化不足致染色不均匀，复染对也不能得到对比鲜明的色彩，另外流水冲洗时间的长短对组织返蓝色彩鲜艳与否也有一定的关系。须要提及的是，染色的成败除染色技术以外，组织材料的过分陈旧或长期固定在甲醛中的组织，由于过度酸化都会影响染色；或组织固定不当，固定不足组织发生自溶等均会使染色模糊。伊红染色后必须经梯度酒精脱水，特别需要经过无水乙醇，脱水一定要彻底，否则，影响透明。脱水后，经二甲苯进行透明，才能封固。透明应注意时间充足，才能达到良好效果。封片时，中性树胶不能滴加太多或太少。封固好的切片应平放在摊片盘上，及时放置于恒温箱中40-50烘烤15小时左右，有利于切片的保存
14、。,组织化学术(histochemistry),组织化学术(histochemistry)为应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学的原理和技术,与组织学技术相结合而产生的技术,能在组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否、以及分布状态.还可进一步用显微分光光度计或图象分析仪测定光镜切片中该物质反应的强度,获得定量的信息.应用这种技术于游离细胞的样品(如细胞涂片),则称细胞化学术(cytochemistry).,一般组织化学术,一般组织化学术 基本原理是在切片上加某种试剂,和组织中的待检物质发生化学反应,其最终产物或为有色沉淀物,以用光镜观察,或为重金属沉淀,以用电镜观察.,糖类:常用过
15、碘酸希夫反应(periodic acid Schiff reaction,PAS 反应)显示多糖和糖蛋白的糖链.糖被强氧化剂.过碘酸氧化后,形成多醛;后者再与无色的品红硫酸复合物(即希夫试剂)结合,形成紫红色反应产物.,PAS反应阳性过碘酸Schiff反应(periodic acid Schiff reaction)，是确定组织或细胞中有无多糖存在的一种方法。氧化 Schiff试剂 多糖 醛 紫红色沉淀,脂类:标本用甲醛固定,冷冻切片,用油红O、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料染色,使脂类(脂肪、类脂)呈相应颜色.亦可用锇酸固定兼染色,脂质呈黑色.,核酸:显示DNA的传统方法为孚尔根反应(Feulge
16、n reaction).切片先经稀盐酸处理,使DNA分解;再用希夫试剂处理,形成紫红色反应物.,如果同时显示DNA和RNA,则用甲基绿-派若宁反应.甲基绿与细胞核DNA结合呈蓝绿色,派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色.,酶类:通过显示酶的催化活性来表明酶的存在.程序是将切片置于含特异性底物的溶液中孵育,底物经酶的作用形成初级反应产物,它再与某种捕捉剂结合,形成显微镜下可见的沉淀物,即最终反应物.例如显示酸性磷酸酶,先将切片放入含有酶底物(常用-甘油磷酸钠)的溶液(pH 5.0)中孵育,底物经酶水解,释放磷酸;用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应,形成细微的磷酸铅,亲银性：使硝酸银直接还原而显色嗜银性：
17、加还原剂后才能显色,异染性：用甲苯胺蓝等碱性染料染色后不显蓝色而呈紫红色（肥大细胞）,免疫细胞（组织）化学抗原（antigen,Ag）与抗体（antibody）特异结合，用已知抗体检测未知抗原的一种方法。,对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。,1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。,2.非特异吸附法免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物，
18、然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用2%左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。,免疫组化染色中标识物的选择,用量微小，容易在光镜或电镜下识别机体内无同一物质或类似物质物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，其结合物也稳定,目前常用标识物质有荧光色素、放射性同位素、重金属、微粒子、酶等,设立对照实验,为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。,（1）阳性对照用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。,（2）阴性对照用不含一直抗原的标本作对照，实
19、验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。,免疫组化的结果判断,免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由显著区别。,几种常用的免疫组化检测技术,荧光免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术免疫金（银）组织化学技术免疫标记电镜技术,免疫组化常见问题的处理：1、组织材料的处理：常用的固定液为：10%中性福尔马林
20、液；4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4）；固定时间：8-24hr组织大小：2*1.5*0.3cm,2、防脱片处理：多聚-L-赖氨酸；硫酸铬钾明胶液。3、增强特异性染色的措施和方法：1）、蛋白酶消化：a、胰蛋白酶消化（0.05-0.1%）；b、胃蛋白酶消化（0.4%）。,2）、热诱导的抗原修复：方法：微波960C,10min；直接加温方法 1000C,10min；高压锅 1200C,10min；热处理液：0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液,3）、合适的抗体稀释度：过高，过低均会导致阴性结果。即用型抗体；浓缩型。,4、减少or 消除非特异性染色的方法：非特异性染色：原因：方法：,酶标记,免疫细胞（组织）化学,荧光标记,电子显微镜技术：透射电镜,透射电镜,扫描电镜,电子显微镜技术,透射电镜,扫描电镜,
