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1、,第六章 酶与细胞固定化,直接应用酶的不足之处:(1)酶的稳定性差,在温度、pH和无机离子等外界因素的影响下,容易变性失活(2)酶通常在水溶液中与底物反应，反应结束后，即使仍有较高酶活力，也难于回收利用，成本较高，不便连续化生产(3)酶反应后成为杂质与产物混在一起,增加分离纯化的困难,固定化技术,改善方法之一思路设计一种方法,将酶束缚于特殊的相,使它与整体分开但仍能进行底物和效应物的分子交换.这种固定化的酶可象一般化学反应中的固体催化剂一样既有酶催化特性,又有一般化学催化剂能回收，反复使用等优点,并可使生产工艺连续化自动化.,种类,(1)固定化酶(2)固定化菌体(死细胞)(3)固定化活细胞(增
2、殖细胞)(4)固定化原生质体(5)固定化动植物细胞,优点,(1)提高酶稳定性；(2)可反复或连续使用；(3)易于和反应产物分开；（4）酶反应过程可严格控制；（5）产物溶液无酶残留，简化提纯工艺；（6）较游离酶更适合多酶反应；（7）增加产物收率，提高产物质量；（8）酶的使用效率提高，成本降低。,缺点,（1）固定化时酶活有损失；（2）增加了生产初始成本；（3）只能用于可溶底物且较小分子；（4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应；（5）胞内酶须分离。,第一节 酶固定化,定义酶的固定化:将酶和菌体与不溶性载体结合的过程;固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续进行反应，反应后的酶可回收重复使用;概
3、念发展“水不溶酶”（water insoluble enzyme)“固相酶”（solid phase enzyme)1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶（immobilized enzyme)”,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶（固定化酶）,固定化技术,固定化酶制备原则,（1）维持酶的催化活性及专一性；（2）有利于生产自动化、连续化；（3）应有最小的空间位阻；（4）酶与载体必须结合牢固；（5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或 反应液发生化学反应；（6）成本要低。,一、酶固定化的方法,1、吸附法(link)2、包埋法(link)3、结合法(link)4、交联法
4、(link)5、热处理法(link),酶固定化方法示意图,吸附法,用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法;固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等;(1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用;(2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.,back,包埋法,将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中的固定化方法多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚酰胺、火棉胶等,(1)凝胶包埋法,天然凝胶条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较差合成凝胶强度高，耐温度、pH值变化强，因需聚合反应而使部分酶变性失活适用性不适用于底物或产物分子很大的酶类的固
5、定化,(2)半透膜包埋法,半透膜聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几十埃，比酶分子直径小适用性底物和产物都是小分子物质的酶微胶囊直径一般只有几微米至几百微米?,微胶囊型固定化酶,制备,酶+亲水性单体溶于水,疏水性单体溶于有机溶液,混合,乳化剂,乳化,酶液分散成小水滴,亲水性、疏水性单体在两相界面上聚合成半透膜，将酶包埋,Tween-20 破乳,离心,半透膜,酶液滴,（3）胶格包埋法,首先被采用的胶格包埋法是：固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙稀酰胺,丙稀酰胺引发剂inactiation,back,结合法,选择适宜的载体,通过载体的共价键或离子键(非共价健)与酶结合在一
6、起的固定化方法,酶,载体,(1)离子键结合法,载体:DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等不溶于水的离子交换剂操作:将酶液与载体混合搅拌几个小时;或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱;活力损失少,结合力较弱，条件(pH值和离子强度)改变时,酶易脱落,(2)共价键结合法,是载体结合法中报道最多的方法;载体分类:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质等;也可分三类:天然有机载体(多糖、蛋白质、细胞）、无机物（玻璃、陶瓷）、合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙）方法载体活化:借助某种方法，在载体上引进某一能够与酶分子上某一基团反应的活泼基团优点:结合很牢固，酶可连续使用较长时间缺点:操作
7、复杂，共价结合可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性,载体活化方法,1、重氮法;2、迭氮法;3、溴化氰法;4、烷基化法.,重氮法,将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团,迭氮法,含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成迭氮化合物,溴化氰法,含有羟基的载体，如纤维素等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物,烷基化法,含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体,back,交联法,借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构特点此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是不使用载体双功能试剂戊二醛、己二胺、双偶氮
8、苯等第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶 得到一种分子间交联的固定化酶,酶,双功能剂,戊二醛:(cf.185）,优点结合牢固，可以长时间使用缺点因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，酶活损失大，颗粒较小，使用不便双重固定化将其与吸附法、包埋法联合使用,图 711 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶,热处理,在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体体内适用性热稳定性较好的酶的固定化严格控制加热及其时间,back,固定化酶方法的优缺点比较,1、稳定性(li
9、nk)2、最适温度(link)3、最适pH(link)4、底物特异性(link),二、固定化酶的性质,稳定性,比游离酶的好（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度,A固定化酶,B游离酶,稳定性(续),（2）保存稳定性好，保存时间延长（3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白（4）对变性剂(如尿素、有机溶剂、盐酸胍等)的耐受性提高，保留较高酶活（5）对酶抑制剂、对不同pH稳定性提高.,(back),最适温度,与游离酶差不多,最适温度(续),例外用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，比游离酶高5-10;以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高5-15 汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为
10、80，比固定化前提高了30 同一种酶;用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能不同,不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度,(back),最适pH值,酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶pH曲线常发生偏移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响,pH对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响,带负电荷的载体，固定化酶最适pH值比游离酶的高,(1)载体的带电性质对最适pH的影响,原因:吸引作用,带正电荷的载体，固定化酶最适pH值比游离酶的低,H+,H+,H+,H+,H+,H+,H+,偏酸微环境,OH-,OH-,OH-,OH-,OH-,OH-,H+,H+,大环境偏碱,酶,不带电荷的载体，固定化酶最适p
11、H值一般不变,(2)产物酸碱性对最适pH值的影响,酸性:固定化酶的最适pH值比游离酶的高碱性:固定化酶的最适pH值比游离酶的低中性:固定化酶的最适pH值一般不变原因:载体障碍产物的扩散,(back),底物的特异性,与底物分子量的大小有关;作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基酰化酶、葡聚糖氧化酶等;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酶蛋白的作用仅为游离酶的3%左右原因:载体的空间位阻作用,(back),影响固定化酶性能的因素,固定化酶制备物性质取决于所用的酶及载体材料的性质(1)酶固定化后的
12、变化主要是活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化(2)载体影响主要是在固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用等引起的变化(3)固定化方法的影响.,总结起来有,1、质量传递效应:酶的固定化意味着酶的机动性受到精确限制,从而影响溶质的运动性能,这种现象即质量传递效应;载体材料表面外部的扩散限制分配效应内部扩散限制效应交联酶晶体催化反应速率不受扩散限制?2、支持物产生的（静态的）和反应产生的（动态的）质子梯度:固定化酶的酶活力-pH曲线有可能迁移34个pH单位;溶质分子带电基团和载体上静电荷相互作用引起水解反应中,当固定化酶释放质子时也能够观察到动态的质子梯度;
13、3、固定化酶的稳定性和产率:当生产花费和传质效应被缩小后,固定化酶主要消费是由酶所能使用的时间决定的(稳定性),为了获得最高利润,增加固定化酶稳定性至关重要;通过分析酶活力随时间的损耗来测定酶的稳定性,三、固定化酶的应用,1、工业生产(link)2、酶传感器(link)3、药物控释载体（link),go,固定化酶在工业生产中的应用,(1)氨基酰化酶Aminoacylase首例，1969年，日本田边制药公司，DEAE-葡聚糖凝胶固定化酶,拆分DL-酰氨基酸，连续生产L-aa，成本降低40%左右。,乙酰-DL Ala L Ala+乙酸乙酰-D Ala,固定化酶在工业生产中的应用(续),(2)葡萄糖
14、异构酶规模最大。1973年。热处理法，国内外广泛研究和应用。(3)天门冬氨酸酶1973年，日本，聚丙烯酰胺凝胶为载体固定化具高活力天冬氨酸酶的大肠杆菌，包埋法，将延胡索酸转化成L-天冬氨酸。1978年，角叉菜胶固定化纯酶，离子键结合法。(4)青霉素酰化酶1973年，催化青霉素或头孢菌素水解6-氨基青霉烷酸(6-APA）或7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA),也可催化感6-APA或7-ACA+羧酸衍生物合成不同侧链基团的青霉素或头孢霉素;,固定化酶在工业生产中的应用(续),(5)延胡索酸酶1974年，由延胡索酸制L-苹果酸，聚丙烯酰胺包埋法，产氨短杆菌。1977年，由延胡索酸制L-苹果酸，角叉菜胶包
15、埋法，黄色短杆菌(6)-半乳糖苷酶1977年，水解乳中的乳糖生产低乳糖奶(7)天门冬氨酸-脱羧酶1982年，天门冬氨酸生产L-丙氨酸。假单孢菌，凝胶包埋,Back,固定化酶在酶传感器方面的应用,酶传感器固定化酶+能量转换器(电极、场效应管、离子选择场效应管)，属于生物传感器的一种酶电极:固定化酶+电极，应用最广泛;用途:临床诊断、工业发酵过程控制、环境监测,go,生物传感器,用生物活性材料（酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等）与物理、化学传感器有机结合的一门交叉学科，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控手段，也是物质分子水平的快速、微量分析方法;在未来21世纪生物经济发展中，
16、生物传感技术将是介于信息和生物技术之间的新增长点;中国生物传感器的研究起步于 70年代末期。早期研究普遍采取氧电极作生物反应中的换能器,以葡萄糖氧化酶为活性材料,一、概述,生物传感器(续),早期的血糖速测仪,我国第一种实用化的生物传感器-SBA-30型乳酸分析仪,维生素C速测仪,生物传感器(续),传感器能将一种被测信号（参量）转换成一种可输出信号的装置。生物传感器(biosensors):用生物成分作为感受器的传感器。由感受器、换能器、电子线器组成,二、生物传感器组成和工作原理,感知固定化配基与待测物结合产生的微小变化，把这种变化转化为其它可识别信号，其质量好坏决定了传感器的灵敏度。,换能器,
17、是生物传感器的心脏，整个生物传感器的核心技术也在此。制备分两方面工作，一是选择最佳载体材料（需活化）；二是在载体表面固定化亲和配基（非共价和共价）,感受器,生物传感器(续),SBA-60型生物传感在线分析系统,back,葡萄糖氧化酶电极,1962年 Clark和Lyons提出模型1967年 Updike和Hicks首先制造聚丙烯酰胺凝胶包埋法固定化葡萄糖氧化酶，酶膜强度2050um基本结构酶膜+多分子膜(聚四氟己烯等)+氧电极,图5-1 葡萄糖氧化酶电极,半透膜酶胶层感应电极酶电极示意图D葡萄糖O2 D葡萄糖酸1，5内酯H2O,葡萄糖醌H2O葡萄糖酸氢醌,葡萄糖氧化酶,氢醌 醌2H2e,Pt,
18、铂电极,脲电极,Urea+2H2O 2NH4+2HCO3-,脲酶,产生的2NH4+为阳离子电极感应。,此外还有：氨基酸电极醇电极尿酸电极乳酸电极青霉素电极亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3,青霉素酶电极,酶膜:青霉素酶+聚丙烯酰胺凝胶(或光交联树脂)电极:pH电极结合:酶膜紧贴在玻璃(pH)电极上反应:,青霉素+H2O 青霉烷酸+H+,青霉素酶,表5-1 一些常用的酶电极,back,固定化酶在酶传感器方面的应用(续),图4、SBA-40型谷氨酸葡萄糖双功能分析仪,图5、SBA-50型糖化酶生物传感分析仪,SBA-70型生物传感在线血糖乳酸自动分析系统,固定化酶在酶传感器方面的应用(续)
19、,Back,药物控释载体,药物应用临床不顺利的原因:蛋白类药物被胃酸破坏被肝和血液中的酶系统清除药物本身毒副作用免疫问题药物稳定性差建立合理的给药体系，核心是从时间和空间分布上控制药物的释放控释体系涉及到将药物与聚合物载体偶联或固定于某种聚合物载体上，也称载体药物(1)聚合物修饰(2)凝胶包埋(3)微球制剂(4)脂质体(5)导向药物,Back,一、细胞固定化的方法二、微生物细胞固定化三、植物细胞固定化四、动物细胞固定化,第二节 细胞固定化,第六章 酶与细胞固定化,概 念,固定化细胞就是被限制自由移动的细胞,即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内,但细胞仍保留催化活性并具有能被反复
20、或连续使用的活力;固定化细胞的研究和应用始于20世纪70年代,后来居上,实际应用超过固定化酶,与固定化酶比较的优越性:(1)细胞密度大,可增殖,可获得高度密集而体积缩小的工程菌集合体,不需多次培养,缩短了发酵周期(2)发酵稳定性好,可长时间反复或连续使用,有希望将发酵罐改变为反应柱连续生产(3)有利于产品分离纯化保持了胞内酶系的原始状态与天然环境,更稳定,对多步催化转换优势更加明显,无需辅酶再生;尤其是固定化增殖细胞局限性(1)利用的仅是胞外酶;(2)细胞内多酶的存在会形成不需要的副产物;(3)细胞膜、细胞壁和载体等都存在扩散限制作用;(4)载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性。,一、细胞
21、固定化的方法,固定化酶和固定化细胞都是以酶的应用为目的,其制备方法和应用方法也基本相同,1、吸附法,利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定的方法。吸附剂硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。优点操作简便易行，不太影响细胞的生长、繁殖和代谢缺点吸附力较弱，细胞易脱落,实例,2、包埋法,将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法。有凝胶包埋法和半透膜包埋法之分，前者常用,二、微生物细胞固定化,(1)保持了细胞完整结构和天然状态,稳定性好;(2)保持了原酶系,按原代谢途径进行新陈代谢;(3)发酵稳定性好;(4)细胞密度提高,提高产率;(5)提高工程菌质粒
22、稳定性。,(一)固定化微生物细胞的特点,(二)固定化微生物细胞的应用,(1)酒精类:固定化酵母生产酒精、啤酒、蜂蜜酒、葡萄酒、米酒。(2)氨基酸:谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、瓜氨酸、色氨酸、异亮氨酸等(3）有机酸:固定化黑曲霉生产苹果酸、柠檬酸、葡萄糖酸、衣康酸、乳酸等(4）酶和辅酶:淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶等胞外酶;辅酶A、NAD、NADP、ATP等辅酶。(5）抗生素:青霉素、四环素、头孢霉素、杆菌肽等。(6)其它:甾体转化、废水处理、有机溶剂、维生素、化工产品等。,1、生产各种胞外产物,(1）呼吸活性测定型利用固定在高分子膜上的微生物细胞的呼吸作用，测定氧气的消耗和CO2的生成，由固定化
23、微生物膜和氧电极或CO2电极结合而成(2）电极活性测定型利用固定在膜上的微生物细胞的新陈代谢作用，测定电极活性物质的量的变化，从而确定样品中欲测物质的含量，由固定化微生物膜与生物燃料电池、离子选择电极和气体电极等组成。,2、制造微生物传感器,三、植物细胞固定化,植物:天然色素、香精、药物和酶的重要资源,百日花,紫草,植物细胞培养:80年代发展起来，工业化生产天然产物的新途径存在问题:植物细胞体积大，对剪切力较敏感，生产周期长，易聚集成团，发酵生产稳定性较差，产率不高,(一)固定化植物细胞的特点,(1)可减轻剪切力和其它外界因素对植物细胞的影响(2)不容易聚集成团(3)便于更换不同的培养液(4)
24、可反复使用或连续使用(5)利于产品的分离纯化,(二)植物细胞固定化方法,例:用中空纤维为载体进行植物细胞固定化优点近乎于植物体内物质的传递与交换方式，有利于细胞的生长和代谢的进行缺点(1)有时纤维管会因阻塞而影响传质；(2)成本较高，难以大规模应用,1、吸附法,2、包埋法,1979年，Brodelius等人，用海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化长青花细胞、毛地黄细胞等,四、动物细胞固定化,动物细胞培养：生产激素、酶和免疫物质存在问题(1)体积大，没有细胞壁保护，培养过程易受剪切力等外界因素影响；(2)生长缓慢，培养基组分复杂、昂贵，产率不高。解决办法动物细胞固定化,（一）固定化动物细胞的特点,(1)
25、提高细胞存活率，载体保护，附着生长(2)提高产率，便于变更发酵培养基,使细胞从生长期转到生产期(3)反复或连续使用较长时间，利于连续化、自动化生产(4)易于产物分离纯化,（二）动物细胞固定化方法,常用载体转瓶、微载体、中空纤维等,1、吸附法,玻璃或塑料，表面经过处理(如用高锰酸钾等氧化剂、强酸、强碱或紫外光照射)而带上电荷优点设备简单，操作容易。缺点比表面积较小，细胞生长繁殖受到限制改善转瓶内加进列管或多层平板,(1)转瓶,由带负电表面电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等制成，直径一般为10200微米。1967年问世，已有多种商品出售。优点表面积大，(S/V达到150),对
26、细胞生长和物质传递有利。缺点机械强度不够，易破碎，使用寿命短。,(2)微载体,操作方式同植物细胞固定化，1972年Knazek首创。,(3)中空纤维,2、包埋法,琼脂糖凝胶包埋：琼脂糖加热溶化，冷却后与动物细胞混合，分散在石蜡油中，降温至10 C左右，得到的微球状固定化细胞海藻酸钙凝胶包埋：动物细胞与海藻酸钠溶液混合,然后用注射器将其滴到氯化钙溶液中,形成固定化细胞.血纤维蛋白包埋：动物细胞与血纤维蛋白原混合，加入凝血酶，使血纤维素蛋白原转化为不溶性的血纤维蛋白,(1)凝胶包埋法:,适用于悬浮动物细胞,(2)半透膜包埋法,利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，形成直径为1-2mm的微囊型
27、固定化动物细胞例海藻酸钙-聚赖氨酸(ALG-PLL）包埋动物细胞用海藻酸钙凝胶包埋用聚赖氨酸处理，使胶囊外层包上聚赖氨酸膜泡在柠檬酸钠溶液中，使海藻酸钙凝胶溶解.,固定化细胞的缺点,(1)只能够生产胞外酶和其它能够分泌到细胞外的产物(2)由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制。(3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键性的限制因素原因之一:细胞壁对物质扩散的障碍,原生质体,微生物细胞和植物细胞除去细胞壁后就可获得,固定化原生质体的优点:,(1)保护了原生质体(2)利于氧的传递、营养成分的吸收和胞内产物的分泌。,第三节 原生质体固定化,一、原生质体的制备,原则破坏细胞壁而不伤
28、及细胞膜及细胞内部结构方法酶法，根据不同细胞壁用不同的酶,原生质体图,过程,(4)离心分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞和酶。,(1)收集细胞(对数生长期),(2)加入适当的渗透压稳定剂(无机盐、糖类、糖醇等),防止原生质体破裂,(3）加入适宜的细胞壁水解酶，在一定的条件下作用一段时间，使细胞壁破坏,原生质体释放,二、原生质体固定化,把离心收到的原生质体重新悬浮于含有渗透压稳定剂的缓冲液中,1、预处理,凝胶包埋法琼脂-多孔醋酸纤维素固定化法海藻酸钙凝胶固定化法角叉菜胶固定化法光交联树脂固定化法,2、固定化方法,三、固定化原生质体的特点,(1)增加细胞膜通透性,有利于氧气和营养物的传递和吸收,利于胞内物质分泌,提高产率;(2)可反复使用连续使用较长时间;(3)易与产物分开;(4)需添加渗透压稳定剂.,中试规模,1986年，华南理工大学，固定化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，产率提高36%,可连续生使用37天。固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化酶，90%以上分泌到发酵液中。,胞内酶的生产,四、固定化原生质体的应用,
