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1、生物大分子的结构与功能,第 一 篇,Structure and Function of Biomacromolecule,概 述,蛋白质,生物的特征由生物大分子决定。,核酸,多糖,脂质复合物,生物大分子包括：,蛋白质的结构与功能,第 一 章,Structure and Function of Protein,一、什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,生物体的基本组成成分之一，在生命过程中承担各种生物功能。,Pr功能大分子,二、蛋白质的生物学重要性,分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞
2、的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，脾、肺及横纹肌组织含量高达80。,1.蛋白质是生物体重要组成成分,1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储5）运动与支持作用6）参与细胞间信息传递,2.蛋白质具有重要的生物学功能,3.氧化供能,蛋 白 质 的 分 子 组 成The Molecular Component of Protein,第 一 节,组成蛋白质的元素,有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼、硒，个别蛋白质还含有碘。,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,体内的含氮物质以蛋白质为主（蛋白氮），
3、测定生物样品中的含氮量，就可以推算出蛋白质的大致含量：,蛋白质的含量=蛋白氮 6.25,1/16%,蛋白质元素组成的特点,一、氨基酸,组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种；均属-氨基酸；均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,组成蛋白质的基本单位：,L-氨基酸,L-氨基酸构型,非极性疏水性氨基酸（中性氨基酸）极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,二、氨基酸的分类,侧链R基团的极性的不同，按它们在中性溶液中侧链的解离状态分为：,非极性疏水性氨基酸,结构式 中文名 英文名,三字符号,一字符号,等电点（PI）,2.极性中性氨基酸,3.酸性氨基酸,4.碱性氨基酸,按氨基酸侧链R的结构分为：,1.脂肪族氨基酸,3.
4、杂环族氨基酸 组氨酸、脯氨酸,2.芳香族氨基酸,几种特殊氨基酸,脯氨酸（亚氨基酸）,甘氨酸（非手性碳原子）,半胱氨酸,胱氨酸,生物体内的氨基酸,生蛋白氨基酸：,20种编码aa,非生蛋白氨基酸：,蛋白质中不存在的非编码aa,瓜氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸,修饰氨基酸：,蛋白质合成后加工修饰的aa,胱氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸,三、氨基酸的理化性质,（一）两性解离及等电点,等电点(isoelectric point,pI),在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，即氨基酸所带的净电荷为零，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,pH=pI,pHpI,pHpI,等电的兼
5、性离子净电荷为零,阳离子,阴离子,氨基酸的等电点,等电点的计算：,侧链R基不解离的中性氨基酸 等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：,甘氨酸的等电点：,有个可解离基团的氨基酸：先写出他们的解离公式，取等电兼性离子两边的pK值的平均值，即为该氨基酸的pI。,H,（二）紫外吸收,色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,色氨酸 max=280nm 280=5.6103,酪氨酸 max=275nm 275=1.4103,苯丙氨酸max=257nm 275=2.0102,测定蛋白质溶液280nm的光吸收值，对样品蛋白质进行定性、定量分析。,蛋白质的紫外分光光度定量分析,依据lam
6、bert-Beer定律,（三）茚三酮反应,氨基酸与茚三酮水合物共热，生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。常可作为氨基酸定量分析方法。亚氨基酸，脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应，直接生成亮黄色化合物，最大光吸收为440nm。,氨基酸的茚三酮反应,四、多肽链,肽键(peptide bond)一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的酰胺键。,（一）肽(peptide),肽：氨基酸之间通过肽键而互相连接形成 的化合物。,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,*肽链中的氨基酸分子称为氨基酸残基(residue)。,*由十个以内氨基酸相连而成
7、的肽称为寡肽，更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,*多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,*习惯上把39个aa残基的促肾上腺皮质激素称多肽，51aa残基的胰岛素称蛋白质。,多肽链有两端,*多肽链的书写方式和命名,(N端),(C端),H2NGlyIleValGluCys AspCOOH,H2N 甘 异 缬 谷 半 天 COOH,H2N G I V E C N COOH,牛胰岛素的一级结构,肽和蛋白质在分子量上没有明显的划分胰岛素（51个氨基酸残基）：蛋白质，促肾上腺皮质激素（39个氨基酸残基）：多肽。,（二）几种生物活性
8、肽,1.谷胱甘肽(glutathione,GSH),-羧基,巯基,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,GSH的巯基具有还原性,体内保护蛋白巯基不被氧化。还原体内的H2O2，抗氧化作用。,许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2.多肽类激素及神经肽,牛催产素bovine oxytocin,牛加压素bovine vasopressin,舒缓激肽bradykinin,蛋白质的分子结构The Molecular Structure of Protein,第 二 节,二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary structu
9、re)四级结构(quaternary structure),蛋白质的分子结构包括：,一级结构(primary structure),定义,一、蛋白质的一级结构,主要的化学键,多肽链中氨基酸的排列顺序和氨基酸的连接方式。,肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,牛胰岛素的一级结构,一级结构是蛋白质空间结构和特异生物学功能的基础。,二、蛋白质的二级结构,蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，描述该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，不涉及氨基酸残基侧链的构象。,定义,主要的化学键：,氢 键,（一）肽单元(peptide unit),肽单元（肽单位，肽平面）构象,1、肽键C-N的键长为0.132nm，介于C-
10、N单键(0.147nm)和C=N双键(0.128nm)之间,且更接近双键的键长。,肽单元的构象特征,肽键与其相连的4个原子共处于一个平面上。,肽键具有部分双键的性质。,围绕 C 和N 原子的三个键角度之合为360。,2、肽键平面上的各原子可呈顺反异构关系,氧与氢呈反式结构，两个碳也互为反式结构。,3、与碳原子相连的单键可以旋转。相邻两个肽键平面的相互位置关系就取决于碳两侧单键旋转的角度（N-C用表示；C-C用表示）。,以肽键平面为基本单位的旋转是肽链折叠、盘旋（蛋白质二级结构）的基础。,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋(-helix)-折叠(-pleated sheet)-转角(-turn)无
11、规卷曲(random coil),（二）-螺旋,-螺旋结构具有以下主要特征：,碳的和分别为-57和-47，每圈含3.6个氨基酸残基，其中每个氨基酸残基升高0.15nm，螺距为0.54nm。,以碳原子为转折点，以肽键平面为单位，形成的右手螺旋。,每个氨基酸残基羰基氧与它后面第4个氨基酸残基的-氨基氮上的氢之间形成氢键，每个肽键的-NH-与-CO-均参加氢键的生成，螺旋从每个氢键-NH-至-CO-共包含13个主链原子。,氢键方向大致与螺旋中心轴平行，侧链R基团伸向螺旋的外侧。,侧链R基团的大小、电荷对-螺旋形成及稳定有影响。,较大R基团(如Ile、Trp等)集中的区域，空间位阻影响-螺旋的形成；甘
12、氨酸R基团占位小，肽平面旋转自由度大，难于参与形成稳定的螺旋；酸性或碱性氨基酸集中的区域，由于同性电荷相斥，不利于螺旋的形成；脯氨酸是亚氨基酸，形成肽键后不能参与氢键的形成，不形成螺旋。,（三）-折叠,-折叠（-片层，-折片）,-折叠结构的特点：,是多肽链中最为伸展的结构，相邻两个肽键平面间折叠成锯齿状。,由并行的两条以上肽链或一条肽链回折内部的两段肽链形成的。链间肽键C=O与N-H之间形成氢键，侧链R基团交替位于片层的上方和下方。,-折叠有两种类型,顺向平行：两条肽链的走向方向相同，肽链间形成的氢键有明显弯曲。,-折叠有两种类型,反向平行：两条肽链的走向方向相反，氢键近于平行。从能量角度考虑
13、，反平行式更为稳定。,（四）-转角和无规卷曲,一条肽链形成180的回折；由36个氨基酸残基组成，一般以4个残基（含3个肽键平面）常见，第一个残基羰基氧与第四个残基氨基氢形成氢键。,-转角,泛指那些不能被归入明确二级结构的多肽区段；实际上它们大多数既不是卷曲，也不是完全无规则的。,无规则卷曲,（五）模体（motif）,在结构层次上高于二级结构；也称超二级结构(super second structure)。一个模体有其特征的氨基酸序列，并发挥特殊的功能。,由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。,几种类型的超二级结构：,钙结合蛋白中结合钙离
14、子的模体,锌指结构,（六）蛋白质二级结构是由什么决定的？,以一级结构为基础。一段肽链氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，就会出现相应的二级结构。,甘氨酸难于形成-螺旋；酸性或碱性氨基酸残基集中的区域不利于-螺旋形成。脯氨酸不能参与氢键的形成，不能形成-螺旋。,三、蛋白质的三级结构,多肽链在二级结构的基础上进一步盘旋、折叠，形成的空间构象。,（一）三级结构,一般非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核，极性侧链在分子表面。,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，包括主链和侧链的所有原子的空间排布。,稳定三级结构的主要化学键,离子键、氢键、疏水键、Van der Waals力等次级键。二硫键,大分
15、子蛋白质可折叠成一个或数个结构较为紧密的区域，并各行其功能。,（二）结构域(structural domain,domain),多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成的三级结构的局部折叠区。较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。,磷酸酶结构域(2),（三）分子伴侣(molecular chaperon),分子伴侣：在天然蛋白质合成过程中，一些参与蛋白空间构象形成的蛋白质。,伴侣素（chaperonin）GroEL和GroES家族,广泛存在原核、真核细胞一类保守蛋白质,热休克蛋白(heat shock protein,Hsp)HSP70、HSP40和GreE族,核质蛋白
16、（nucleoplasmin）,可逆地与未折叠肽段结合随后松开，使肽链正确折叠。与错误的肽段结合，诱导其正确折叠。二硫键的正确形成。,可能的作用机制,自身不含结构折叠信息；提供加速蛋白质折叠成天然构象的环境。,分子伴侣特点：,四、蛋白质的四级结构,由二个以上具有独立三级结构的多肽链通过非共价键相互结合而成的结构。,每条具有独立三级结构的多肽链称为蛋白质的亚基(或亚单位，subunit)。描述蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用。亚基之间的结合力主要是氢键和离子键。,单独的亚基没有生物学活性。四级结构的亚基可以是相同的，也可以不同。亚基间的聚合较疏松，在一定条件下可以解聚成
17、各独立的亚基。,四级结构特点,由一条多肽链构成，或两条以上多肽链通过共价键连接的蛋白质不具有四级结构。,血红蛋白的四级结构,蛋白质分子结构小结,1.蛋白质结构,2.维系蛋白质分子的作用力,一级结构：肽键、二硫键二级结构：氢键三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键四级结构：氢键、盐键,五、蛋白质的分类,根据蛋白质组成成分,根据蛋白质形状,(脱辅基蛋白质)（辅基）apoprotein prosthetic group,纤维状蛋白质：球状蛋白质：,单纯蛋白质的分类,结合蛋白的分类,按蛋白质的主要功能分类,六、蛋白质组学,一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质，即“一种基因组所表达的全套蛋白质”
18、。,蛋白质组（proteome）,蛋白质组学（proteomics）,蛋白质表达图谱蛋白质翻译后修饰图谱蛋白质亚细胞定位图谱蛋白质与蛋白质之间的相互作用,蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein,第 三 节,（一）一级结构与空间构象的关系,一、蛋白质一级结构与空间结构和功能的关系,蛋白质的氨基酸序列（蛋白质的一级结构）决定了蛋白质的空间结构。,一级结构是空间构象的基础,牛核糖核酸酶的一级结构,二硫键,天然RNA酶分子,变性RNA酶分子(二硫键被还原),天然条件折叠下,核糖核酸酶的变性与复性实验,蛋白质上的一维信息控
19、制多肽链自身折叠成天然构象，并由此确定两个Cys的正确位置。二硫键对于形成蛋白质的天然构象可能是不重要的，但对稳定空间结构是重要的。,复性过程二硫键的正确配对表明：,为什么蛋白质的空间构象主要是由氨基酸序列决定的？,肽键平面的性质以及C-C 和C-N旋转角度;肽链中各种氨基酸的数目，位置;侧链基团的相互作用、溶剂和溶质的相互作用。,蛋白质的空间结构是多肽链上各个单键旋转自由度受到各种限制的总结果。,形成热力学上最稳定的结构,（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能,同源蛋白质(homologous protein),不同生物体中，具有同一功能的蛋白质。,（三）氨基酸序列提供生物进化信
20、息,比较一些广泛存在于生物界的蛋白质的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。,如细胞色素(cytochrome C)，,人乳清蛋白,鸡蛋溶菌酶,丝氨酸蛋白酶类 显示明显的序列同源性,镰刀形红细胞贫血(sickle-cell anemia),分子病：由蛋白质分子发生变异所导致的疾病。,（四）氨基酸序列改变可引起疾病,二、蛋白质空间结构与功能的关系,由于蛋白质折叠发生错误，使构象发生变化，严重时可导致疾病的发生。,酶变性时其空间结构被破坏，引起生物活性的丧失。当蛋白质复性后，构象复原，活性即恢复。,Pr空间结构是其各种生物学功能的基础。,Pr构象发生变化，其功能活性也随之变化。,（一）变构效应(
21、allosteric effect),当某种小分子物质特异地与某种蛋白质(或酶)分子的别构部位结合时，能触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的改变(增强或减弱)。,引起蛋白质变构效应的物质,变构蛋白：,具有变构效应的蛋白质,变构效应剂：,血红蛋白的构象变化,氧合Hb：与O2结合后Hb；,氧百分饱和度：氧合Hb占总Hb的百分数，随O2浓度变化而改变。,肌红蛋白与血红蛋白的结构,（二）协同效应(cooperativity),正协同效应(positive cooperativity)配体结合后促进其它亚基与配体结合的作用,一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个
22、亚基与配体结合能力的现象。,负协同效应(negative cooperativity)配体结合后抑制其它亚基与配体结合的作用,血红蛋白氧合与脱氧构象转换,T型,R型,血红素与氧结合：,铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中；,F肽段的移动引起肽链位置的变动；导致亚基末端盐键断裂。,（三）蛋白质构象改变与疾病,若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象疾病,蛋白质折叠病,错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀的病理改变，产生毒性而致病。,人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨廷顿舞蹈病、疯牛病等。,蛋白质构象
23、改变导致疾病的机理,这类疾病包括：,致病因子是不含核酸的蛋白质；,疯牛病中的蛋白质构象改变,由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起 的一组人和动物神经退行性病变。,PrP两种形式,疯牛病,蛋白质结构与功能的关系小结,空间结构是蛋白质生物功能的基础,蛋白质的功能要求有与之相适应的一级结构。,一级结构是空间构象的基础,第四节,蛋白质的理化性质The Physical and Chemical Characters of Protein,（一）蛋白质的两性电离,一、蛋白质的理化性质,蛋白质分子的解离基团：,当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即净电荷为零，此
24、时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质的等电点(isoelectric point,pI),两端的氨基和羧基，氨基酸残基侧链中某些基团。,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量1万至100万，其分子大小介于1100nm，为胶体质点范围。具有胶体溶液的性质。,胶体质点 颗粒表面电荷 表面形成水化膜,蛋白质溶液稳定的因素,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固,在一定条件下，破坏溶液中蛋白质的稳定因素，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。,1.蛋白质的沉淀,除去水化膜改变pH至等电点,概念,沉淀蛋白质的主要方法,盐析法：,中性盐：硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等原理：使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀,有机
25、溶剂沉淀法：,极性有机溶剂：甲醇、乙醇或丙酮等原理：使蛋白质脱去水化层并降低溶液介电常数,当溶液pH小于等电点时，蛋白质带有正电荷，与生物碱试剂和酸根负离子结合生成不溶性盐而沉淀。,重金属盐沉淀法,当溶液pH大于等电点时，蛋白质带有负电荷，与重金属离子（Hg 2+、Pb 2+、Cu 2+、Ag+）结合生成不溶性盐而沉淀。,生物碱试剂和某些酸类沉淀剂,在某些物理和化学因素作用下，天然蛋白质的空间构象受到破坏，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失。,2.蛋白质的变性(denaturation),造成变性的因素,物理因素：加热、超声波化学因素：乙醇等有机溶剂、脲、胍、强酸、强碱、重金属离子及生物
26、碱试剂。,蛋白质变性的本质,维系蛋白质空间结构的次级键受到破坏，使蛋白质从有序而紧密的结构，变为无序而松散的结构。,不涉及共价键的（肽键和二硫键）断裂，一级结构保持完好。,蛋白质变性过程中，常伴随下列现象,生物活性的丧失；蛋白质侧链基团的暴露；物理化学性质的改变：溶解度降低、粘度增加、结晶能力丧失、凝集易形成沉淀。生物化学性质的改变：分子结构伸展，易被蛋白水解酶降解。,蛋白质的复性(renaturation),若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质可恢复或部分恢复其原有的构象和功能。,蛋白质变性有时是可逆的，有时是不可逆的。,临床上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。,防止蛋白质变性是有效保
27、存蛋白质制剂（如疫苗、各种蛋白、酶制剂等）的必要条件。,蛋白质经强酸或强碱作用后，仍可溶于强酸或强碱中，如将溶液的pH调至等电点，蛋白质形成絮状不溶物，加热后凝固。,蛋白质的凝固作用(protein coagulation),加热使蛋白质变性沉淀；少量盐类可促进蛋白质加热凝固；当蛋白质处于等电点时，加热凝固最快和最迅速。,（四）蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。,蛋白质定性、定量测定。,（五）蛋白质的呈色反应,茚三酮反应(ninhydrin reaction),双缩脲反应(biuret reaction),蛋白质NH
28、2末端的氨基酸残基有茚三酮反应。,用于蛋白质的定性和定量测定。,蛋白质和多肽分子在稀碱溶液中与硫酸铜共热，肽键可与Cu2+形成络合物呈现紫色或红色。,检测蛋白质水解程度，蛋白质定量测定。,第四节,蛋白质的分离纯化与结构分析The Separation，Purification and structural analysis of Protein,一、蛋白质的分离和纯化,细分级分离,前处理,粗分级分离,材料的选择，细胞破碎，蛋白质抽提。,盐析和有机溶剂分级分离除盐、浓缩,层析法密度梯度离心电泳,（一）分离步骤,前处理,粗分级,细分级,蛋白质分离纯化的一般程序,（二）常用的分离方法,是将硫酸铵、硫
29、酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,盐析(salt precipitation),水溶液中较大的溶解度 二价中性盐,1.沉淀法,硫酸铵,使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,加入极性有机溶剂，使蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加蛋白颗粒之间的相互作用而聚集沉淀。,有机溶剂沉淀法,将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,免疫沉淀法,2
30、.透析及超滤法,透析(dialysis),利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，除去蛋白质中的盐以及小分子化合物的方法。,超滤法(ultrafitration),用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,（三）层析,待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固定相时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,层析(chromatography)分离蛋白质的原理,以离子交换剂为支持物，根据各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。,离子交换层析,原理,常用层析介质,离子交换
31、纤维素,阳离子弱酸型CM-纤维素阴离子弱碱型DEAE-纤维素,以多孔的网状凝胶颗粒为介质，利用各蛋白质分子大小不同进行的层析分离。,凝胶过滤：又称分子筛层析、分子排阻,原理,是惰性、多孔的网状凝胶颗粒，凝胶的交联度（网孔大小）决定了凝胶的分级分离范围。,分子筛介质,葡聚糖凝胶（Sephadex）聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P）琼脂糖凝胶(Sepharose or Bio-gel A),利用蛋白质分子对其配体特有的识别和结合能力，建立的一种有效的层析方法。,亲和层析(affinity chromtography),原理,常用配体,抗原抗体酶底物、竞争性抑制剂,（四）超速离心(ultracen
32、trifugation),分离纯化蛋白质。用作测定蛋白质的分子量。,蛋白质分子在离心力作用时，当蛋白质的密度大于溶液的密度，就会发生沉降。沉降的速度与蛋白质分子大小和密度、分子形状、溶液的密度和粘度有关。,原理,主要应用,因为沉降系数大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,在离心场中，蛋白质分子受到的净离心力(离心力减去浮力)与溶剂的摩擦阻力平衡时，蛋白颗粒以恒定速度移动，单位离心场的沉降速度称为沉降系数，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。,沉降系数(sedimentation coefficient,S),（五）电泳
33、(elctrophoresis),蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电颗粒，在电场中能向正极或负极移动。通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术。,迁移率(mobility)：蛋白质在电泳中的移动速度。取决与蛋白质所带的净电荷、分子大小和形状。,在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基磺酸钠（SDS），使蛋白质覆盖上相同密度的负电荷，则蛋白分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子量，而与原来所带电荷和分子形状无关。常用于蛋白质分子量的测定。,几种重要的蛋白质电泳,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,等电聚焦电泳：,在具有pH梯度的介质(如浓蔗糖溶液)进行电泳，在外电场的作用下各种蛋白质移向并聚焦（停
34、留）在其等电点的pH梯度处。,双向凝胶电泳：,第一向：等电聚焦电泳。第二向：SDS-PAGE。,在二维平面上进行电泳。,三、多肽链中氨基酸序列分析,蛋白质的氨基酸的组成,测定多肽链的数目(亚基或分子内的二硫键)末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,(一)氨基酸测序,蛋白质纯化,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法(异硫氰酸苯酯法,PITC),一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,(二)通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列,按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,分离编码蛋白质的基因,测定DNA序
35、列,排列出mRNA序列,四、蛋白质空间结构测定,二级结构测定,圆二色散光谱(circular dichroism，CD),旋光率随平面偏振光的波长不同而变化的光学现象-旋光色散。旋光物质对左右偏振光的吸收不同，产生椭圆偏振光，其消光摩尔系数之差-圆二色性。,=L-R,主要用于-折叠、-片层、无规则卷曲的含量测定,和核磁共振技术(NMR)激光拉曼光谱中子衍射技术,三级结构测定,X射线衍射法(X-ray diffraction),单色X射线(0.0110nm)通过由晶胞组成的晶体时产生的衍射，根据衍射线的方向和强度确定晶体结构的方法。,*用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。,根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构,*通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。,作 业,总结本章的主要概念；蛋白质各级结构内容和稳定因素；举例论述蛋白质结构与功能的关系。,
