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1、流式的原理及临床应用,杭州辉图生物有限公司技术支持部 胡荣连,什么是流式细胞仪？,检测流动中细胞（颗粒）的仪器目标物可以是细胞、细菌或各种微粒0.5um50um范围内,流式细胞仪原理介绍,流式细胞仪基本原理示意图,流式细胞仪检测什么信号？,细胞,抗原,抗体,荧光,激光束,通过流式细胞仪我们可以得到以下信息-相对细胞颗粒密度和内部复杂度(SSC)-相对细胞大小(FSC)-染色过细胞的相对荧光强度,流式细胞仪标本准备染色的一般原则及方法,标本来源：,外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。以及血清或各类体液样本。,抗体染色一般方法,外周血白细胞分析：100ul全血血小板分析：15ul全血（
2、根据样本血小板数量）红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使用）骨髓：100ul其他样本，计数后决定使用体积,目标细胞数量及检测终浓度：1106/ml,孵育、溶血、固定,抗体孵育：室温下避光15分钟（某些情况下如：细胞内因子检测需冰育）溶血：如样本含中有红细胞需溶血样本溶血后离心上机检测（固定后可放置较长时间）,流式细胞仪分析报告及图谱,SS（侧向散射光）-反应细胞内物质的多少,FS（前向散射光）-反应细胞大小,设门：选择要分析的细胞群体,设定阴性、阳性范围,目前流式细胞仪临床检测项目,流式细胞仪的临床应用,HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分
3、析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27检查血小板功能及相关疾病,1、HLA-B27的检测,强直性脊柱炎（ankylosing spondylistis）意为弯曲的脊柱。它是和种慢性、进行性和炎性疾病，主要累及骶骼关节、脊柱、脊柱骨软组织及四肢关节，表现为椎间盘维环和纤维环附近结缔组织的骨化，椎间动关节和四肢关节滑膜的炎症和增生，严重者可失去劳动能力。强直性脊柱炎是血清阴性脊柱关节病中具有代表性的疾病，临床上曾长期把AS 误认为是类风湿性关节炎的一个亚型，60 年代以来人们才认识到期无论从病因学、遗传学、流行病学和临床表现特点等诸多方面来看，A
4、S 都是一种不同于类风湿性关节炎的独立疾病。就目前的研究文献而言，HLA-B27 与AS 并非绝对相关，有些AS 患者表现为HLA-B27阴性，而且并非所有HLA-B27 阳性者均出现AS 症状。,B27与强直性脊柱炎,HLA-B27诊断的临床意义,强直性脊柱炎90-100%的强直性脊柱炎患者HLAB27为阳性。但是HLA-B27阳性的人群中只有820是强直性脊柱炎。瑞特综合征6590瑞特综合症患者HLA-B27为阳性。如果HLAB27+个体是非淋菌性尿道炎，那么有20-25%的可能性发展为瑞特综合症，只有1的可能性正常。HLAB27不是该疾病发生的必要条件，但是却与病程发展有紧密联系。“反应
5、性关节炎”是一种自身限制的少关节型关节炎伴随着革兰氏阴性细菌如杆菌性痢疾，沙门氏菌，弧形杆菌，耶尔森氏菌和至贺氏菌引起的胃肠感染。银屑病关节炎-90%的银屑病关节炎联合荐肠关节炎和脊椎炎患者HLA B27阳性。急性前葡萄膜炎通常表现为疼痛，畏光和流泪。可能是虹膜感染或结合了睫状体或视网膜萎缩。青少年风湿症/慢性关节炎II 这些儿童中75为HLA B27+。相反，青少年风湿症/慢性关节炎I，同样也是少关节性的，但是更常见于女孩，与慢性虹膜睫状体炎(30%)，阳性的ANA(80%)和HLA DR5关联，却不是B27。,HLA-B27的临床检测,HLA-B27属于1型MHC基因。基本上表达在机体所有
6、有核细胞上，特别是淋巴细胞表面有丰富的含量。使用荧光定量标准微球，校正HLA-B27实验条件后，测定样本中T淋巴细胞HLA-B27表达水平。若HLA-B27表达水平大于标准微球设定MARK，则为阳性结果；若HLA-B27表达水平低于标准微球设定MARK，则为阴性结果。Anti-HLA-B27 Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340183)，其中包括：1、Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE 2、HLA-B27 Calibration beads 3、FACS Lysing Solution,HLA-B27流式细胞仪检测,2、淋巴细胞亚群分析,淋巴细胞亚群基础知
7、识,T淋巴细胞：主要杀伤病原体感染细胞及肿瘤细胞。表面标志物：CD3，与TCR形成复合体，是T细胞识别抗原和转导信号的主要单位。CD3+/CD4+：辅助性T细胞CD3+/CD8+：杀伤性T细胞,CD8+T细胞又称细胞毒性T细胞，Tc或CTL，它在T细胞免疫应答中发挥重要功能。Tc细胞识别抗原活化后释放胞浆内颗粒毒素：穿孔素perforin和颗粒酶granzyme，杀伤靶细胞。,B淋巴细胞,B淋巴细胞是免疫系统中的抗体产生细胞。1，产生的抗体可与抗原起特异性的结合，如中和细菌的外毒素使其失去毒性作用；2，抗体与抗原结合后形成的复合物易被吞噬细胞清除；3，抗体与抗原结合后再结合补体清除病原体。B细
8、胞特异性标志物：CD19,NK细胞,NK自然杀伤细胞：识别病毒感染细胞表面表达的相应配体，NK细胞一经识别病毒感染细胞后即对之施加杀伤作用。NK细胞表面标志物：CD3-/CD16+CD56+,通过淋巴细胞亚群的检测可了解在不同情况下体内免疫功能状态，辅助临床疾病的诊断，探索疾病发病机理、病程、预后，监测、指导临床治疗方案。,淋巴细胞亚群的临床检测,总T和总B判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病,T-淋巴细胞上升多见于：慢性活动性肝炎或慢性迁延性肝炎；器官移植排斥反应；重症肌无力；甲亢与甲状腺炎患者；何杰金病T-淋巴细胞下降多见于：恶性肿瘤；自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等；原发性免
9、疫缺陷病，如生天性胸腺发育不全等、艾滋病；接受放疗、化疗或者使用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂B-淋巴细胞上升多见于：多发性骨髓瘤；巨球蛋白血症；淋巴瘤；艾滋病 B-淋巴细胞下降多见于：原发性免疫缺陷病，如性联无丙种球蛋白血症等、恶性肿瘤 T-淋巴细胞与B-淋巴细胞同时下降多见于：联合免疫缺陷病，如重症状联合免疫缺陷病等,CD4+和CD8+T细胞有助于监测患有免疫缺陷疾病（如SCID、AIDS的病人体内CD4+细胞亚群的百分率相对降低，而CD8+群体的百分率相对升高），自身免疫性疾病（如在SLE病人中，CD8+淋巴细胞的相对百分比往往会降低，但当使用类固醇药物治疗时，也可能上升。在急性GVHD和移
10、植排斥中，CD8+淋巴细胞所占的比例有可能在正常人的范围之外）,Th和Ts淋巴细胞的百分数,CD4+/CD8+的比值：评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻击 CD4/CD8 升高：自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、SLE。CD4/CD8 降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血等。,Th/Ts比值,自然杀伤细胞（NK）,NK细胞增高常见于：某些病毒感染性疾病的早期；长期使用干扰素或使用干扰素的诱导物；骨髓移植后；习惯性流产。NK细胞降低常见于：恶性肿瘤，特别是中晚期或伴有转移的肿瘤；免疫缺陷病及
11、使用肾上腺激素等免疫抑制剂。部分病毒感染、细菌感染及真菌感染；某些白血病及白血病前期。,恶性肿瘤患者T 细胞亚群和SIL22R 的变化及意义卢香兰1,李霞1,王萍萍1,李玲2,李艳1 3 4 2 中国医科大学学报J Chin Med Univ 第33 卷第3 期2004 年6 月,疾病 T 细胞亚群 CD4+/CD8+CD4+CD8+类风关（活动期）SLE-或（活动期）Sjogren综合症 多发性硬化症 重症肌无力 膜型肾小球肾炎 胰岛素依赖性糖尿病 乙型肝炎 自身溶血性贫血 上呼吸道感染 传染性单核细胞增多症（急性期）,巨细胞病毒感染 乙肝（急性期/慢性肝炎）结核（胸水/重症外周血）麻风 疟疾 血吸虫病 AIDS CD4+/CD8+CD3+CD4+CD8+肿瘤 再障及粒细胞减少症 巨细胞病毒感染 血小板减少 活动性特应性皮炎 过敏性皮炎,BD四色淋巴亚群检测试剂盒：MultiTEST CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC MultiTEST CD3 FITC/CD16+56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC,Q&A,
