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1、第八章 微生物与基因工程第一节微生物与基因工程的关系第二节 基因工程的基本过程,基因工程是指对遗传信息的分子操作和施工。即把分离的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量的基因产物或者令生物表现出新的性状。其核心是构建重组体DNA技术。简单地说基因工程就是运用重组DNA技术改造生物的性状。,基因工程是一种DNA 的体外重组技术，是根据人们的需要，在分子水平上用人工方法取得供体 DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再移入原体细胞，使转录翻译及复制，表达出供体基因原有的生物学特性。,这种使 DNA分子进行重组，再在受体细胞内无性繁殖的技术也被称为分子无性
2、繁殖或分子克隆、重组DNA技术。,通过基因工程改造后的菌株被称为“工程菌”。,基因工程是一门崭新的生物技术。它的出现标志着人类已经能够按照自己意愿进行各种基因操作，大规模生产基因产物，并可设计和创建新的蛋白质和新的生物物种。,DNA的特异切割、DNA分子克隆、DNA快速测序这三项技术的建立为基因工程奠定了基础。,第一节微生物与基因工程的关系,微生物与基因工程的关系密切，基因工程的产物和发展依赖于微生物学的理论和技术。微生物在基因工程中的兴起和发展过程中起着不可替代的作用。可以说一切基因工程操作都离不开微生物。,基因工程所用载体不是微生物就是微生物的质粒。基因工程所用的千余种工具酶绝大多数是从微
3、生物中分离纯化得到的。微生物细胞是基因工程中基因克隆的宿主，即使是植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物或动物细胞中。,微生物和微生物学在基因工程中的重要性,为了大规模表达各种基因产物，从事商业化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或者是酵母菌中以构建工程菌，利用工厂发酵来实现。微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源。有关基因的结构、性质和表达调控的理论主要是从微生物的研究中取得的，或者是将动物、植物基因转移到微生物中后研究而获得的。,一、微生物
4、与克隆载体,克隆载体（cloning vector）：外源DNA片段进行克隆，需要一个合适的载体将其运送到细胞中并进行复制和扩增。这种以扩增外源基因为目的的载体称为克隆载体。,把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体（vector）。,作为克隆载体的条件是：,载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制，因此载体应是一个复制子；载体必须具有若干个限制酶的单一切割位点，便于外源基因的插入。并且这些酶切位点应位于载体复制的非必要去，故插入适当大小外源DNA片段后载体仍能进行正常的复制。载体必须具有可供选择的遗传标记。如抗生素的抗性基因等。,基因工程中使用的
5、载体基本上均来自微生物，主要包括6大类：质粒载体；噬菌体载体；柯斯质粒载体；M13噬菌体载体；真核细胞的克隆载体；人工染色体等。,载体的选择,1）是一个有自我复制能力的复制子（replicon),2)能在受体细胞内大量增殖，即有较高的复制率。,3）载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上。,4）载体上必须有一种选择遗传标记，以便及时将“工程菌”选择出来。,1、质粒克隆载体,（1）、质粒载体,质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，经人工修饰改造后作为克隆载体具有十分有利的特性：具有独立复制起点；具有较小的相对分子质量，一般不超过15kb；具有较高拷贝数
6、，使外源DNA得以大量扩增；易于导入细胞；具有便于选择的标记和具有安全性。,2、噬菌体克隆载体,噬菌体克隆载体是基因工程中一类很有价值的克隆载体，具有很多优点：其分子遗传学背景十分清楚；载体容量较大，一般质粒载体只能容纳10多个kb，而噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段；具有较高的感染效率，其感染宿主细胞的效率几乎可达100%，而质粒DNA的转化率却只有0.1%。,但野生型噬菌体DNA的分子很大，基因结构复杂，限制酶有很多切点，且这些切点多数位于必需基因之中，因而不适于作为克隆载体，必需经一系列改造才能用作克隆载体。,构建噬菌体载体克隆载体的基本原则是：删除基因组中非必需区，使基因
7、组变小，有利于克隆较大的DNA片段；除去多余的限制位点。,3、柯斯质粒载体,柯斯质粒载体（cosmid vector）即粘粒载体，是由噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。柯斯质粒载体含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，以及来自噬菌体粘性末端的DNA片段，即cos位点，其对于将DNA包装成噬菌体粒子是必需的。,柯斯质粒载体的优点：具有噬菌体的高效感染力，而在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在；具有质粒DNA的复制方式，重组DNA注入宿主细胞后，两个cos位点连接形成环状DNA分子，如同质粒一样进行复制；具有克隆大片段外源DNA的能力，柯斯质粒本身一般只有57
8、kb左右，而它可克隆外源DNA片段的极度限值竟高达45kb，远远超过质粒载体及噬菌体载体的克隆能力。,4、M13噬菌体载体,M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状ssDNA，大小为6 407bp。感染雄性（F+或Hfr）大肠杆菌并进入细胞后转变成复制型（RF）dsDNA，然后以滚环方式复制出ssDNA。每当复制出单位长度正链，即被切出和环化，并立即组装成子代噬菌体和以出芽方式（即宿主细胞不被裂解）释放至胞外。,野生型M13不适于直接作为克隆载体，因此人们对其进行改造，构建了一系列M13克隆载体。,5、噬菌体质粒载体,噬菌体质粒（phagemid或phasmid）是由丝状噬菌体和质粒载体DN
9、A融合而成，兼有两者优点，这类载体具有来自M13或f1噬菌体的基因间隔区（内含M13或f1噬菌体复制起点）和来自质粒的复制起点、抗药性标记、一个多克隆位点区等。,噬菌体质粒载体在应用上具有许多优点：载体本身分子小，约为3 000bp，便于分离和操作；克隆外源DNA容量较M13噬菌体载体大，可克隆10kb外源DNA片段；可用于制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因。,6、真核生物的克隆载体,真核生物载体，主要有以下几大类：,（1）、酵母质粒载体、附加体质粒（epislmal plasmid）、复制质粒（replicating plasmid）、整合质粒（integrating plasmid）
10、,（2）、真核生物病毒载体、哺乳动物病毒载体、昆虫病毒载体、植物病毒载体,7、人工染色体,酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）是一类目前能容纳最大外源DNA片段人工构建的载体。,酵母染色体的控制系统主要包括三部分：着丝粒（centromere,CEN），它的作用是使染色体的附着粒与有丝分裂的纺锤丝相连，保证染色体在细胞分裂过程中正确分配到子代细胞；端粒（telomere,TEL），位于染色体两个末端，功能是保护染色体两端，保证染色体的正常复制，防止染色体DNA复制过程中两端序列的丢失；酵母自主复制序列（autonomously replicating
11、 sequence,ARS）其功能与酵母细胞复制有关。,表达载体的构建,基因工程的主要目的是使外源基因能在细菌、酵母或动、植物细胞中得到高效表达，以便获得大量有益的基因表达产物或改变微生物或动、植物的遗传性状。,所谓表达载体（expression vector）是指宿主细胞基因表达所需调节控制序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。也即克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅可使外源基因扩增，还可使其表达。原核生物和真核生物的表达载体有一些共同的要求，但两者的基因表达调控机制有很大不同，故需要分别采用原核生物和真核生物的调控原件来构建。,1、表达系统的要求与主要调
12、控元件,表达系统的要求与主要调控元件包括：,启动子、,核糖体的结合位点、,转录终止信号,密码子偏爱性,等。,2、表达载体中调节开关的作用,通常表达载体不应使外源基因始终处于转录和翻译之中。这是由于某些有价值的外源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将影响细胞生长；此外某些载体的启动子是强启动子，如T7启动子，强启动子的表达非常强以致使正常宿主基因不能表达。,基于以上事实，宿主细胞的生长和外源基因的表达应该分成两个阶段进行。第一阶段使含有外源基因的宿主细胞迅速生长直至获得足够量的细胞。第二阶段是启动开关，使所有细胞外源基因同时高效表达，产生大量有价值的表达产物。,在原核基因表达调控中
13、，阻遏蛋白操纵基因系统起着重要调节开关的作用。当阻遏蛋白与操纵基因相结合时，能够阻止基因的转录。加入诱导物，使其与阻遏蛋白结合，解除阻遏，从而启动基因转录。,二、微生物与基因工程工具酶,基因工程所用的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化获得的。,对DNA片段进行操作，必须要有能“切短”DNA的得心应手的工具。工具酶就是对不同来源的DNA片段进行切割拼接组装。在分离目的基因或切割载体时，需利用特异的限制性核酸内切酶对DNA进行准确切割。在构建重组DNA时，需要DNA连接酶催化，使目的DNA片段与载体DNA进行连接。,1、限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶（restriction endon
14、uclease）或简称为限制性酶（restriction enzyme）是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶.,其作用是在分离目的基因或切割载体时对DNA进行准确切割。如：大肠杆菌的EcoR，流感嗜血杆菌的Hind，肺炎克雷伯氏杆菌的Kpn等等。EcoR中E是大肠杆菌属名的第一个字母，co是种名的头两个字母，R是株名，表示该菌第一个被分离出来的酶。,限制性核酸内切酶EcoRI的作用,同裂酶：有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。,同尾酶：有些来源不同的限制酶，识别和切割序列各不相同，但却能产生相同的粘性末端，这类限制酶称为同
15、尾酶。,将不同的DNA片段连接在一起的酶叫DNA连接酶。DNA连接酶主要来自T4噬菌体和大肠杆菌。DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5 端磷酸与3 端羟基之间形成磷酸二酯键。它既能催化双链DNA中单链切口的封闭，也能催化两个双链DNA片段进行连接。,2、DNA连接酶,DNA连接酶主要有两种：一种是T4 DNA连接酶：T4DNA连接酶由一条多肽链组成，相对分子量为6 800Da，通常催化粘性末端间的连接效率要比催化平末端连接效率为高。催化反应需要Mg2+和ATP，ATP作为反应的能量来源。T4 DNA连接酶在基因工程操作中被广泛应用。另一种是大肠杆菌DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶的相对
16、分子量为7 500Da，连接反应的能量来源是NAD+，此酶催化DNA连接反应与T4 DNA连接酶大致相同，但不能催化DNA分子的平端连接。,体外DNA连接方法目前常用的三种：（1）用T4或E.coli DNA连接酶可连接具有互补粘性末端的DNA片段；（2）用T4 DNA连接酶连接具有平末端DNA片段；（3）先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，然后再进行连接。,三、微生物作为克隆载体的宿主,为了保证外源基因在细胞中的大量扩增和表达，必须选择合适的克隆载体宿主。一个理想的克隆载体宿主。,宿主基本要求是：能够高效吸收外源DNA；具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；不具有限制修饰系统，
17、故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA发生降解；一般为重组缺陷型（RecA-）菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组；便于进行基因操作和筛选；具有安全性。,原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母，由于他们具有生长迅速、极易培养，能在廉价培养基上生长，遗传学和分子生物学背景十分清楚等突出优点，已成为当前被广泛应用的重要克隆载体宿主。另外还有枯草杆菌和昆虫细胞系等。,第二节 基因工程的基本过程,基因工程操作主要步骤为：分离或合成基因（切），通过体外重组将基因插入载体（接），将重组DNA导入细胞（转），扩增克隆基因（增），筛选重组体克隆（检），对克隆的基因进行鉴定或测序，控制
18、外源基因的表达，得到基因产物或转基因动物、转基因植物、工程菌（利用基因工程技术获得的具有新功能的微生物称为工程菌）。,一、目的基因的分离或合成,1，从基因文库中筛选基因文库是指生物染色体基因组各DNA片断的克隆总体（即某一特定生物体全基因组的克隆集合）。人们可以根据目的基因的性质和序列从中筛选。,2，cDNA法,目的DNA可用反转录酶以mRNA为模板来合成。（以该蛋白质的单克隆抗体纯化该基因的核糖体，再洗脱下编码该蛋白质的特异mRNA，直接反转录成cDNA，进行基因克隆。）cDNA文库是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。根据目的基因的特性可
19、从中筛选。,3，化学合成法,如果目的基因的全序列是已知的，则可以利用化学合成法直接合成。2kb的基因序列。,二、体外重组,目的基因用酶切下来，同时打开载体DNA分子，然后将两者连接成杂合分子。,三、重组DNA导入细胞,DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。重组DNA人工导入受体细胞有许多方法，包括转化、转染、接合、受体细胞的电穿孔和显微注射等等。,1，外源DNA导入原核细胞,（1）转化或转染如果外源DNA以重组质粒载体形式存在，则可通过转化导入原核细胞；如果外源DNA被构建成重组
20、噬菌体DNA或重组噬菌体质粒，则可通过转染方式进入细胞。,（2）噬菌体的体外包装和感染,如果外源DNA被包装成噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染机制导入细胞。体外包装是将重组DNA分子与噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，从而组装成完整的具有感染力的噬菌体粒子。,2，外源DNA导入真核细胞,（1）外源DNA导入酵母细胞重组DNA以转化方式导入酵母细胞的原生质体。（2）外源DNA导入哺乳动物细胞微量注射和电穿孔法为主，还有磷酸钙共沉淀转染法、聚阳离子转染法、原生质体融合法等等。,（3）外源DNA导入植物细胞,有微量注射、电穿孔法、共培养法、叶片培养法、基因枪法等等。,共培养法：,共培养法是指将含
21、有重组Ti质粒的根癌土壤杆菌与植物原生质体共培养。叶片培养法是指含有重组Ti质粒的根癌土壤杆菌与植物叶片共培养。基因枪法是利用微弹把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速射进植物的细胞、组织或幼苗。,四、转化细胞的扩增,转化细胞的扩增是指受体细胞经转化后立即进行短时间的培养。如原生质体转化后的细胞壁再生等。,五、转化子的筛选和重组子的鉴定,在制备目的基因时对染色体进行了切割，产生大量的DNA小片断，故进入受体细胞的克隆不仅有目的基因，而且有大量不需要的基因，所获得的是含有不同克隆子的细胞群体。在DNA体外重组中，外源DNA片断与载体DNA的连接反应物一般不经分离直接用于转化，,由于重组率和转化率不
22、可能达到100%的理想极限，因此必须使用各种筛选与鉴定手段区分转化子（接纳载体或重组子的转化细胞）与非转化子，重组子（含有重组DNA分子的转化子）与非重组子（仅含有空载载体的转化子），以及期望重组子（含有目的基因的重组子）与非期望重组子（不含有目的基因的重组子）。,方法：,将转化扩增物稀释一定的倍数后，均匀涂布在用于筛选的特殊培养基上，使之长出肉眼可分辨的菌落或噬菌斑（克隆）。然后进行新一轮的筛选鉴定。,1、载体遗传标记法（重组体表型特征的鉴定）,原理是利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子。,抗药性筛选（抗生素平板法）营养缺陷性筛选 显性模型筛选 噬菌斑法 探针重组
23、筛选,抗生素平板法：,如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素基因之外，将转化的重组体细胞置于含有该抗生素的培养基平板上，仍可长成菌落。,插入失活性：,是一种因外源DNA的插入而导致基因失活的现象。如，pBR322质粒上具有一个四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr），已知有24种主要的限制酶在pBR322上都只有一个切点，其中有7种限制酶的切点位于四环素抗性基因之内，3种限制酶的切点位于氨苄青霉素抗性基因（Ampr）之内，外源DNA片段插入这些位点之中的任一位点将导致相应的抗性基因失活。,插入表达法：,在某些载体的标记基因前面连接一段负控制序列，当外源DNA片段插入该负控
24、制序列中，使负控制序列失活，因而位于下游的标记基因因解除阻遏而得到表达。,-半乳糖苷酶显色反应法：,许多大肠杆菌的载体质粒上含有lacZ/标记基因，它包括大肠杆菌-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列以及氨基端146个氨基酸残基的编码序列，其表达产物是无活性的不完全酶，称为受体；而许多大肠杆菌的受体细胞在染色体DNA上含有-半乳糖苷酶羧基端的部分编码序列，由其产生的蛋白质也无活性，但可作为供体。,受体和供体一旦结合，便可恢复-半乳糖苷酶的活性，将5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）底物水解成篮色产物。当外源DNA片段插入到位于lacZ/标记基因内部的多克隆位点上时，生长在含有X-g
25、al的平板上的重组子因lacZ/基因的灭活而成白色，非重组子则显蓝色。异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导物。,2、重组DNA分子结构特征的鉴定,菌落或噬菌斑原位杂交法又称探针原位杂交法，前提条件是必须拥有与目的基因某一区域同源的探针序列。根据核酸杂交的原理，探针序列特异地杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团进行定位检测。,方法步骤：,醋酸纤维素滤膜覆盖在菌落上，用针扎不对称的三个孔（标记），37 OC培养1-2h滤膜NaOH裂解细菌中性缓冲液中和NaOH清洗缓冲液浸泡3min洗去菌体碎片和蛋白晾干后800C下干燥12h固定DNA单链高温高离子强度下（降低本底）与探针杂交稍低离子浓度
26、溶液清洗膜三遍（除去未特异杂交的探针），晾干X-光胶片暗箱内曝光。根据胶片上感光点的位置，在原始平板上挑取相应菌落。,内切酶图谱鉴定,在外源DNA片断大小以及限制性酶切图谱已知的情况下，对重组子进行酶切鉴定，不仅能区分重组分子与非重组分子，有时还能初步确定期望重组子与非期望重组子。,将初步筛选的阳性克隆即转化子小量培养后，提取重组质粒或者重组噬菌体的DNA。用内切酶酶切，然后进行电泳。检测插入DNA片段大小。分子量大于载体质粒的为重组子，最终利用载体上的已知酶切位点，建立重组质粒插入片段的酶切图谱，并与已知数据进行比较，进而确定期望重组子。,全酶解法：,用一种或两种限制性内切酶切开质粒DNA上
27、所有相应的酶切位点，形成全酶切图谱。,部分酶解法：,通过限制酶量或限制反应的时间使酶切位点发生切割反应，产生相应的部分限制性片段，显然这些片段大于全酶片段，因此能确定同种酶多个切点的准确位置。,重组子快速搜寻法：,（EcoRI-Hind联合酶切BamHI酶切PstI酶切）。,PCR鉴定,用与插入片段两侧互补序列作为引物，以重组质粒DNA作为模板，进行PCR分析，可快速测出插入DNA片段大小及鉴定其序列特异性。,DNA序列测定,为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组的DNA进行序列测定。（以便最终获得目的基因的编码序列和基因调控序列，精确界定基因的边界）,a.DNA的化学降解测序法,b.DNA
28、的双脱氧末端终止测序法（国际目前常规测序方法）c.其它：如DNA全自动序列分析系统，超薄水平凝胶电泳技术，基因芯片杂交测序，扫描隧穿显微镜测序等等。,注：,一般DNA序列测定前，鉴定出期望重组子后，要进行目的基因的定位。如果期望重组子中外源DNA比目的基因长，则目的基因在DNA片段上所处的位置必须确定。以便删除非目的基因的DNA片段，简化目的基因的进一步分析。,3、外源基因表达产物的鉴定,如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过检测这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子。这种方法应用的前提是重组分子必须含有能在受体细胞中发挥功能的表达元件。也就是说外源基因必须表达其编
29、码产物，并且受体细胞不能合成这种蛋白质。,表达产物免疫活性测定（又称放射免疫原位检测法）,如果（前提条件）表达产物是一种蛋白或蛋白质的一部分，它具有抗原性可与其特异抗体发生免疫反应。此法操作类似于菌落原位杂交：硝酸纤维素薄膜印膜处理滤膜裂解菌落释放蛋白固定处理后与第一抗体反应洗膜后再与标记的第二抗体反应检测。第二抗体可以用同位素标记也可以用生物素或酶标记。,表达产物生物活性检查,若表达产物是一种酶，可测定其酶活性。若表达产物是一种酶抑制剂，可测定其抑制酶活性能力的大小。,蛋白质凝胶电泳检测法：,从重组克隆中分别制备蛋白质粗提液，以非重组子作对照；走蛋白凝胶电泳。新谱带-期望重组子（应剔除载体基
30、因表达的产物）。,表达产物氨基酸序列测定,测定表达产物“N”端氨基酸序列。,探针获取的方法：,A：目的基因的同源序列B：cDNAC：人工合成一般最佳探针长度范围为100-1000bp，另外探针内部不能含有大面积的互补序列。,3、基因文库与cDNA文库的构建,利用重组DNA技术，可将某一原核微生物或真核微生物染色体基因组的全部遗传信息贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库（genomic library）或cDNA文库（cDNA library）之中，犹如将文献资料贮存于图书库一样，以供长期贮存和随时调取克隆基因使用。,基因文库和cDNA文库的构建,（1）、基因文库的构建所谓基因文库是指生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息即全部DNA序列。,（2）、cDNA文库的构建所谓cDNA文库是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但由于细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数小得多（通常大约仅有15%左右基因被表达），因而若由mRNA逆转录为cDNA，那么所构建的cDNA文库的库容量相应较基因文库小。,
