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1、显微切割技术,研究某疾病发病的分子机制时，常要研究某种特定细胞的基因变化或基因间的相互作用方式在发病中的作用。,常规方法以整块组织为材料研究基因表达变化，所得结果并不能真实反映疾病分子水平的改变。,人体组织是由多种不同类型或不同病变阶段的细胞组成（组织异质性），其中往往还混杂相当数量的炎症细胞。,癌旁组织和癌组织,组织中的炎症细胞,要求选取的研究材料在某一方面具有相同的特征，即具有一定程度的同质性。,随着研究的不断深入需要在组织细胞中分离的研究材料日趋微小（例如要收集分离组织内的单个细胞或细胞内的特殊组分，如核仁或包含体或染色体的某一区带等），常规手段往往不易做到。,核仁,病毒包涵体,原癌基因
2、人类表皮生长因子受体2（human epidermalgrowth factor receptor-2,HER2）基因,定位于染色体17q12-21.32,显微切割技术可以解决这一难题！,一、显微切割技术概述,显微切割技术是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术。,Science.1996 Nov 8;274(5289):998-1001.,Laser capture microdissection.Emmert-Buck MR,Bonner RF,Smith PD,Chuaqui RF,Zhu
3、ang Z,Goldstein SR,Weiss RA,Liotta LA.Laboratory of Pathology,National Cancer Institute,Room 2A33,Building 10,9000 Rockville Pike,Bethesda,MD 20892,USA.Comment on:Abstract Laser capture microdissection(LCM)under direct microscopic visualization permits rapid one-step procurement of selected human ce
4、ll populations from a section of plex,heterogeneous tissue.In this technique,a transparent thermoplastic film(ethylene vinyl acetate polymer)is applied to the surface of the tissue section on a standard glass histopathology slide;a carbon dioxide laser pulse then specifically activates the film abov
5、e the cells of interest.Strong focal adhesion allows selective procurement of the targeted cells.Multiple examples of LCM transfer and tissue analysis,including polymerase chain reaction amplification of DNA and RNA,and enzyme recovery from transferred tissue are demonstrated.,显微切割技术及应用,（一）显微切割的特点,1
6、.取材细微 在显微状态采用特殊的分离收集手段，显微切割的对象可以达到微米级，显微切割的精度可以达到纳米级，可以分离收集到核仁和包含体及染色体特异区带；,2.取材原位准确、同质 在显微镜直视下取材，所取材料的定位清楚准确。可以保证所取材料一定层次上的同质性。可以保证后续实验结果的可靠性！,例如 霍奇金淋巴瘤中瘤组织成分多样，特征性的瘤细胞（RS细胞及其变异型）占细胞成分的2左右，且呈散在性分布，如果常规地用组织匀浆的方式从组织中提取蛋白质或核酸，则既包含了来自瘤细胞的成分，又包含了来自淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、组织细胞等多种非瘤细胞的成分，这样所提的蛋白质或核酸来自何种细胞并不
7、清楚，而如果用显微切割技术则可以选择我们需要的细胞，以使研究对象的背景明确；,3.结合其他技术 显微切割技术在微观领域对研究材料分离收集，可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用。,由于显微切割技术的上述特点，故其在分子病理学研究中的应用十分广泛。,（二）显微切割的方式,1.手动直接显微切割2.机械辅助显微切割3.液压控制显微切割4.激光捕获显微切割(laser capture microdissection),手动直接显微切割是早期的切割方式直接在显微镜下手持切割用针分离组织或细胞群，此种方式切割精度低，只适用于对较大块组织中的局部区域或细胞群进行分离，切割单个细胞十分困难；,1.手
8、动直接显微切割,利用普通光学显微镜的微调旋钮控制切割针切割细胞，切割精度较手动直接显微切割有所提高可以切割较大的单个细胞。此方式简单易行低耗，尤其适合于基层和无专用设备的单位，但由于显微镜的微调旋钮只能进行二维控制，对切割后的细胞进行收集较为困难，且切割精度仍然较低；,2.机械辅助显微切割,液压控制显微切割采用液压式显微操纵系统配合倒置显微镜进行显微切割，它通过液压系统可提供X轴、Y轴和Z轴三个方向的精确的三维控制其切割精度较高、也是很多实验室常用的方法，但其不能实现显微切割的自动化，要收集较大量的目的组分时耗时长，效率低；,3.液压控制显微切割,激光捕获显微切割是目前最为先进的方式，它快速方
9、便，可从大量的研究材料中迅速捕获较多的目的组分，自动化程度高，但这需要昂贵的专用设备。,4.激光捕获显微切割,激光显微切割系统,（三）显微切割的材料 为各种方式贴附于固相支持物上的各种组织细胞成分，石蜡组织切片、冰冻组织切片、细胞铺片、细胞爬片、细胞甩片、培养细胞、常规制备的染色体等。,根据研究目的 不同，选择不同材料 进行RNA分析-采用冰冻组织切片或新制备的细胞片；回顾性研究-福尔马林固定石蜡包埋的组织切片应用最为广泛。,（四）显微切割的结合技术 1.特定结构的识别显示技术 如何识别欲切割的细胞？根据研究的需要可在显微切割前应用组织化学、免疫组织化学、原位杂交、原位末端标记、原位PCR、F
10、ISH、组织特染等方法对需要切割的组织内成分进行标记。需形态学知识,2.如何对已切割的细胞进行分析 显微切割后获得的材料可以用于提取蛋白质、DNA和RNA等用于Western Blot，Southern Blot，Northern Blot，PCR等蛋白质和核酸的相关分析。,3.活细胞显微切割后还可以继续培养,（五）显微切割的影响因素 1.一切与显微切割结合的技术中的影响因素均为显微切割实验最终结果的影响因素,进行RNA的相关分析则所有过程必须确保无RNA酶的降解干扰；,如:,显微切割后与不同方法的结合决定了对切割材料处理不同:,进行基因组DNA的相关分析 应该保持基因组的相对完整性，避免在样
11、品处理过程中造成DNA的降解和断裂，因此需要选择合适的方法进行样品的固定和保存，例如在福尔马林固定石蜡包埋的组织中由于固定包埋剂的影响存在较多的DNA断裂，而且随着保存时间的延长，DNA的断裂越多因此欲分析的DNA需要保持完整时，选择石蜡切片进行显微切割则不合适；,2.分离多少细胞或亚细胞才能满足实验研究的需要，依研究目的、标本固定方式、切片厚度、细胞大小、DNA提取方式、PCR扩增片段长度的不同而有差异,如:显微切割用于DNA分析所需的单个细胞数,冰冻切片至少需要选取10个细胞，而石蜡切片一般需要选取30个细胞。做蛋白质分析需要10 8个细胞。,如果要分析切割细胞中病原微生物的DNA情况、则
12、细胞内病原体的拷贝数越多，需要的细胞数越少。,分析基因组DNA时，细胞越大则需要切割更多的细胞，才能保证包含细胞的全部基因组。冰冻组织切片较石蜡组织切片更适宜于对细胞基因组DNA的分析(后者DNA断裂)。,石蜡组织中存在DNA的断裂，如果要对其切割的细胞进行PCR分析，则扩增的片段越长，需要切割的细胞数越多。,从显微切割的细胞中提取DNA多采取直接法，即采用蛋白酶K消化后再加热灭活酶的方法，这样可以减少在提取过程中DNA的丢失。在采用激光捕获显微切割时或可以切割较多的细胞时也可采用酚氯仿抽提方法提取细胞DNA。,组织切片厚度 在不影响形态观察的前提下，组织切片越厚越好，石蜡组织一般选用7um的
13、连续切片较为适宜。,Science.1996 Nov 8;274(5289):998-1001.,Laser capture microdissection.Emmert-Buck MR,Bonner RF,Smith PD,Chuaqui RF,Zhuang Z,Goldstein SR,Weiss RA,Liotta LA.Laboratory of Pathology,National Cancer Institute,Room 2A33,Building 10,9000 Rockville Pike,Bethesda,MD 20892,USA.Comment on:AbstractLa
14、ser capture microdissection(LCM)under direct microscopic visualization permits rapid one-step procurement of selected human cell populations from a section of plex,heterogeneous tissue.In this technique,a transparent thermoplastic film(ethylene vinyl acetate polymer)is applied to the surface of the
15、tissue section on a standard glass histopathology slide;a carbon dioxide laser pulse then specifically activates the film above the cells of interest.Strong focal adhesion allows selective procurement of the targeted cells.Multiple examples of LCM transfer and tissue analysis,including polymerase ch
16、ain reaction amplification of DNA and RNA,and enzyme recovery from transferred tissue are demonstrated.,（六）显微切割的进展,主要体现在激光捕获显微切割技术的广泛应用，可以快速地精确识别和特异分离单个或群体细胞用于进行下一步的细胞及分子生物学研究，其精确识别是在显微镜下通过细胞形态、免疫组织化学染色及组织化学染色等方法并由计算机辅助实现，而特异分离则是通过低能量红外激光及专用的细胞转移膜实现。激光捕获显微切割通过激光显微细胞分离系统（超微切割刀）实现。,该系统由倒置显微镜、红外激光发射器、真
17、空泵、细胞转移膜及计算机组成。通过显微镜载物台中真空泵固定载玻片，通过附着在离心管盖底的超薄细胞转移膜将由红外激光分离挑选出的细胞转移到离心管中并可以直接被离心管中的提取液所溶解和提取，其提取液的性质可以根据所提取的细胞组分决定，而且所有的细胞分离过程，无论是转移操作还是保存样品都无需任何手工操作，可以实现无污染的细胞分离。,激光显微切割系统,激光显微细胞分离系统通常能够提供三种规格的激光光束直径，它们分别是小于7.5um、15um和30um，小于7.5um光束可以分离挑选单一细胞，15um和30um光束则可以分离挑选较大区域，从而可以保证系统具备较高的准确性和效率以实现对特定细胞或细胞亚群的
18、分离挑选分离前后及被捕获的细胞图像以统一的数据库格式贮存于计算机中。,样品夹,扫描台收集器,(A)LCM of HL and RS cells.A HL tissue section was stained with H 21(3):120125.,(A)LCM of HL and RS cells.,(B)LCM of pure cell populations from a prostate cancer sample.A prostate adenocarcinoma tissue section was stained with H&E(left),and the benign,pro
19、static intraepithelial neoplasia(PIN),malignant,and stromal cells were isolated by LCM,respectively,and visualized on the LCM cap(middle,(B)LCM of pure cell populations from a prostate cancer sample.,Biomol Tech.2010 September;21(3):120125,近年来，激光捕获显微切割技术在分子病理学研究中的应用不断深人，特别是在肿瘤基因突变检测、肿瘤特异基因表达分析、杂合性丢失
20、检测、微卫星序列不稳定性分析、新基因发现、核酸及蛋白质的定量研究、染色体畸变分析、细胞局部病变病因学研究等多种领域进行了广泛应用，取得了许多本技术诞生前无法实现的新研究成果。,二、显微切割技术在分子病理学中的应用 显微切割技术能与分子生物学、免疫学、遗传学、病理学的经典的及现代的多种技术手段相结合，因此其在分子病理学中的应用十分广泛，并且新的研究领域还在不断拓展。,显微切割技术在分子病理学研究中的应用经历了显微组织切割、细胞群切割、单个细胞切割、单细胞内组分切割、染色体切割等阶段，目前应用最为广泛的是分离单个细胞的单细胞显微切割和在染色体水平上的显微切割。,在显微切割的四种方式中，液压控制显微
21、切割和激光捕获显微切割应用最多。从显微切割的最终目的看，目前最多的还是用于对细胞基因的分析，特别是对肿瘤的突变检测和特异的基因表达分析。,在肿瘤分子病理学研究领域里，常常借助于分子生物学的技术进行DNA、RNA的分析，但因为瘤组织是一个异质性的细胞群，肿瘤组织中大量的非瘤成分成为对瘤细胞DNA、RNA进行非原位分析的主要障碍，而显微切割技术正可以解决这类问题。,应用举例,待切割组织片的制备：福尔马林固定石蜡包埋的组织块依病理学常规方法制备7um连续切片，贴于载玻片置烤片机上70烤2h,霍奇金淋巴瘤瘤细胞中突变分析及人巨细 胞病毒（HCMV）检测,二甲苯脱蜡，2次，各10min 100、95、8
22、0、70乙醇、去离子水各2min 10滴苏木精染液1min后置于去离子水洗，5滴返蓝液(0.2Na2CO3，0.04Li2CO3)5min后 去离子水洗；10滴伊红染液lmin后去离子水洗；二甲苯浸泡2次，5min/次，甘油缓冲液(2.5 glycerol；0.05mol/L Tris/HCl，pH8.9；2mmol/L EDTA；1mmol/L NaCl)2min后冷 风机吹干。,依下列步骤处理后不封片用于显微切割：,液压控制显微切割过程：利用日本Narishige液压显微操作系统（Narishige Co.，LTD）结合0lympus倒置显微镜进行显微切割。将直径0.5mm的空心玻璃微管先
23、用显微操纵系统中的拉针器制成用于切割细胞和吸取细胞两种类型尖端大小不同的玻璃针，切割用针尖端约1um，吸取用针尖端约10um；将与显微操纵机械手通过液压相连的持针器固定于显微镜操作平台，再将玻璃针固定于持针器。,在显微镜下找到待切割细胞的视野后，滴加去离子水，在X轴、Y轴、Z轴三个方向上精巧控制显微操纵机械手，用切割针将切割的细胞与周围细胞分割开，使其游离聚集，再用吸取针吸取并吹打人EP管中。在切割前（照片1）、切割中（照片2）、切割后（照片3）可通过与倒置显微镜相连的相机留取资料。从图中可见通过显微操纵系统精细控制下的显微切割，霍奇金淋巴瘤组织中的陷窝细胞可同周围的非瘤细胞精确分离，收集的细
24、胞即可提取DNA用于细胞突变分析和病毒核酸检测。,1 陷窝细胞()显微切割前 400 2 陷窝细胞()显微切割中 400 3 显微切割后陷窝细胞被去除()400,1,2,3,显微切割细胞的DNA提取：将含切割的H/RS细胞的EP管12，000g离心每10个细胞加入5ulTK消化液(05Tween20，0.2mg/ml蛋白酶K)，Vortex混匀后短暂离心，置55水浴过夜；再置烤箱中10min；Vortex混匀后短暂离心供进一步分析用。,1:123 bp 梯度Marker;2:阳性对照;3:阴性对照;416:13 例检测样本,其中4、5、8、9 扩增出149 bp HCMV 片段,图RS/V细胞
25、显微切割后HCMV的PCR检测结果,Kidney International(2000)58,13461353;,IF-LCM:Laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysisHiroshiMurakami,LanceLiotta and Robert AStarRenal Diagnostics and Therapeutics Unit,and Laboratory of Pathology,National Institutes of Health,Bethesda,M
26、aryland,USACorrespondence:Dr Robert A.Star,NIDDK,National Institutes of Health,Building 10,Room 3N108,10 Center Drive MSC 1268,Abstract Background The next phase of the molecular revolution will bring functional genomics down to the level of individual cells in a tissue.Laser capture microdissection
27、(LCM)coupled with reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)can measure gene expression in normal,cancerous,injured,or fibrotic tissue.Nevertheless,targeting of specific cells may be difficult using routine morphologic stains.Immunohistochemistry can identify cells with specific antigen
28、s;however,exposure to aqueous solutions destroys 99%of the mRNA.Consequently,there is an overwhelming need to identify specific tissue cells for LCM without mRNA loss.We report on a rapid immunofluorescent LCM(IF-LCM)procedure that allows targeted analysis of gene expression.Methods A LCM microscope
29、 was outfitted for epifluorescence and light level video microscopy.Heat filters were added to shield the image intensifier from the laser.Frozen sections were fluorescently labeled by a rapid one minute incubation with antiTamm-Horsfall antibody and an ALEXA-linked secondary antibody.Fluorescently
30、labeled thick ascending limb(TAL)cells were detected by low light level video microscopy,captured by LCM,and mRNA was analyzed by RT-PCR for basic amino acid transporter,Tamm-Horsfall protein,and aquaporin-2.Results The immunofluorescently identified TAL could be cleanly microdissected without conta
31、mination from surrounding tubules.The recovery of RNA following rapid immunofluorescence staining was similar to that obtained following hematoxylin and eosin staining,as assessed by RT-PCR for malate dehydrogenase.Conclusions We conclude that the new apparatus and method for the immunofluorescent l
32、abeling of tissue cells targeted for LCM can isolate pure populations of targeted cells from a sea of surrounding cells with highly acceptable preservation of mRNA.Since the TAL is minimally injured following ischemia,identification of the different responses between TAL and surrounding tissue in da
33、maged kidneys may provide new therapeutic targets or agents for the treatment of acute renal failure.,2.肾小管髓袢升支激光显微切割，RT-PCR 分析3种基因,A 2um section of freshly frozen mouse kidney tissue was fixed in 100%acetone and rapidly immunostained with anti-Tamm-Horsfall protein(THP).,(A and B)The immunofluoresc
34、ent and transmitted light image before transfer,respectively.,(C)The fluorescent image of the tissue section after dissection.(D)A fluorescent image of the thick ascending limb(TAL)recovered on the transfer film.The arrow indicates the transferred area.,如何识别欲切割成分,Specificity of IF-LCM capture,RT-PCR
35、 analysis of three genes in TAL sample isolated by LCM,Mouse outer medullary TALs were labeled with THP,rBAT,basic amino acid transporterTHP,Tamm-Horsfall protein AQP-2,aquaporin-2.Positive control(total),pooled sample of RNA harvested from scraped section from same block.Negative control RT(-),tota
36、l RNA from microdissected TAL analyzed without reverse transcriptase.,Each RT-PCR reaction used 7%of the RNA obtained from all of the TALs identified on a single kidney cross-section.,3.激光捕获显微切割技术应用于子宫内膜癌相关基因的研究,A:切割前;B:切割后;C:Cap。正常子宫内膜组织（HE 40）,A,B,C,1、4:DNA marker 2、3:子宫内膜腺管细胞RNA PCR 扩增的-actin 电泳图(1%琼脂糖凝胶),4.Determination of microdissected intranuclear inclusions by PCR,1:123 bp ladders maker;2:Positive control;3:Negative control;4:Exp ected149 bp fragments of human cytomegalovirus.,5.改良手工显微切割法获取特定细胞提取高质量RNA,手工“排除显微切割”法,冰冻切片,常规HE 染色.,食道癌,
