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1、第一章 质谱,1.1有机质谱仪1.1.1 离子化方法1.1.2 质量分析器类型1.2离子结构的确定1.2.1 质谱/质谱基础1.2.2 亚稳离子动能谱(MIKES)1.2.3 碰撞诱导解离(CID)1.2.4 用MI 和 CID谱来确定离子结构1.2.5 离子的热化学1.3质谱裂解机理1.3.1 自由基和电荷中心引发的反应1.3.2 重排反应1.3.3 特征碎片离子1.3.4 影响离子丰度的因素,1.4各类化合物的裂解特征1.4.1 烷烃、环烷烃1.4.2 烯烃1.4.3 炔烃1.4.4 芳香烃1.4.5 醇和苯酚1.4.6 醚1.4.7 醛、酮1.4.8 酯1.4.9 羧酸1.4.10 胺1
2、.4.11 含氮化合物1.4.12 氯代烷烃和溴代烷烃,引言,质谱学及技术发展的历史,上世纪初，英国物理学家Thomson利用放电方法产生正离子，经磁场作用后，记录其谱线，获得第一张质谱图，并发现氖的两个同位素 22Ne 和 20Ne。1918年美国A.J.Dempster用电子轰击的方法，记录了离子的质荷比和相对丰度；1919年美国F.W.Aston制造了第一台精密质谱，并精确测量了50多种元素的同位素及丰度，制出了第一张同位素表，并首次引入“质谱”概念；1942年出现第一台商品质谱仪，标志着质谱学进入一个新的发展阶段；,1957年实现了气相色谱与质谱仪的联用，GC/MS将质谱法在有机分析中
3、的应用推向一个新阶段；60年代，有机质谱迅速发展，高分辩技术已达到实用阶段，几乎同时出现了化学电离、场致电离、场解吸电离等技术；70年代，生命科学的迅猛发展，给分子量测量的权威工具质谱提出挑战，将分子量大、热不稳定性的生物分子如蛋白质、多糖等变成气相离子是质谱亟需解决的关键问题；80年代，出现新的“软电离”质谱技术（如电喷雾质谱ESI、基质辅助激光解吸电离质谱MALDI等），使得生物大分子的测定成为可能;同时解决了LC/MS及CE/MS的接口问题，从而大大拓宽了质谱及其联用技术的应用范围。,1906年Thomson获Nobel物理奖 1986年Paul获Nobel物理奖1996年Kroto等获
4、Nobel化学奖2002年Fenn,Tanaka获Nobel化学奖,质谱技术&Nobel奖,At first there were very few who believed in the existence of these bodies smaller than atoms.I was even told long afterwards by a distinguished physicist who had been present at my 1897 lecture at the Royal Institution that he thought I had been pulling
5、 their legs.J.J.Thomson(1936).Recollections and Reflections.G.Bell and Sons:London.p.341.,The first mass spectrometer,(1856-1940)Cambridge University,Cambridge,Great Britain,The Nobel Prize in Physics 1906.in recognition of the great merits of his theoretical and experimental investigations on the c
6、onduction of electricity by gases,Nobel Laureate(1906):Joseph John Thomson,(1877-1945)Cambridge UniversityCambridge,Great BritainThe Nobel Prize in Chemistry 1922for his discovery,by means of his mass spectrograph,of isotopes,in a large number of non-radioactive elements,and for his enunciation of t
7、he whole-number rule,mass spectrometry of isotopes,Nobel Laureate(1922):Francis William Aston,(1913-1993)University of BonnBonn,GermanyThe Nobel Prize in Physics 1989“For the development of the ion trap technique,Quadrupole and Quadrupole ion trap mass spectrometers,Nobel Laureate(1989):Wolfgang Pau
8、l,(1917)Virginia Commonwealth UniversityRichmond,VirginiaThe Nobel Prize in Chemistry 2002for the development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules,Electrospray ionization of biomolecules,Nobel Laureate(2002):John B.Fenn,1989-ESI of Biomol
9、ecules,“The application of ESI to biomolecules was one of the most important discoveries in mass spectrometry in the latter part of the twentieth century.”,(1959-)Shimadzu CorporationThe Nobel Prize in Chemistry 2002for the development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric ana
10、lyses of biological macromolecules,Matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI),Nobel Laureate(2002):Koichi Tanaka,(1923)Cornell University,Ithaca,New York,A MS pioneer in gaseous ion reactions(the McLafferty rearrangement),instrumentation(GC/MS,LC/MS,MS/MS),techniques(collisionally activated
11、dissociation,neutralization-reionization,electron capture dissociation,IR photodissociation spectroscopy)puter data acquisition,reduction,and identification(Probability Based Matching),reference data(600K spectra),and high resolution MS/MS characterization of biomolecules and gas-phase protein confo
12、rmers.,Innovators,University of Maryland Notable AchievementsBiomedical Applications of Mass Spectrometry Mechanisms of Acquired Drug Resistance Rapid Analysis of Intact Microorganisms by Mass Spectrometry,Mixture analysis by tandem mass spectrometry Kinetic method for measuring ion thermochemistry
13、Surface induced dissociation and ion/surface reactions Hybrid mass spectrometers Energy partitioning in ion dissociation Matrix-assisted desorption/ionization Ion traps:simulations of ion motion,miniaturization,质谱是重要的分析工具,应用相当广泛,其特点可以概括为：,SensitivitySpeedSpecificityStoichiometry,质谱法与其他主要分析方法灵敏度的比较,快
14、速（几分钟完成一次测试）；直观性好：提供分子量信息、结构信息（碎片 离子）；高分辨质谱可以提供元素组成(分子式)；适用性广：气体、液体、固体；混合物可以通过色谱/质谱联用功能及串联质谱功能分离鉴定；应用范围宽：分析化学的各个领域；可以有效地与多种色谱技术联用，如 GC/MS,LC/MS,CE/MS等；自身的串联 MSn 破坏性分析：需汽化、电离；仪器较昂贵、复杂。,第一章 质谱,什么是质谱？质谱是按顺序记录各种质荷比（m/z）离子相对丰度的 谱图。质谱含有样品分子或原子的质量信息。质谱图可以给出大量的结构信息，因此质谱图是化合物的一种化学指纹图谱。,丙酮的EI质谱图,1.1 质谱仪器介绍,离子
15、化方法,电子轰击电离 化学电离 二次离子质谱 ESI MALDI,电子轰击电离（Electron Impact）电子轰击电离使用具有一定能量的电子直接作用于样品分子，使其电离。,在电子轰击电离中，样品分子M受到一定能量的(如70 eV)的电子轰击后，生成分子离子M+。有机化合物的电离能在10 eV左右，所以 M+具有很高的过剩能量，还可能进一步碎裂，产生碎片离子F+等。这些离子在离子源中被加速电压(Vacc)加速后具有一定的动能：,M+e M+2eM+F+N A+B+N.,计算：对于动能为 70eV 的电子，穿过直径为10(1A=10-10 m)的 分子需要多长时间？提示：电子的 m 9.11
16、0-31 kg 1eV 1.6 10-19 J,电子在如此短的时间内(10-16 s)使分子电离。显然，电离速度比振动速度(10-13 10-14 s)快 2 3 个数量级。在发生电离过程中，分子内原子核间距来不及发生改变。因此，电离过程遵守Franck-Condon 原理。,电离过程可借势能图解释。(a)和(b)是两种具有代表性的双原子分子及其分子离子的势能图。(a)中，分子离子与中性分子的能量最低点对应的核间距相等或十分接近，电离生成的 M+处于振动基态的几率最大。这个电离过程需要的能量被称为分子的绝热电离能 IEad。这一情形可用以描述分子失去杂原子上的一个非键电子的电离。(b)中，分子
17、离子的能量最低点对应的核间距大于中性分子的核间距，电离生成的 M+更多地居于振动激发态。图中，0 4 跃迁的几率最大。这个过程需要的能量被称为分子的垂直电离能 IEv。分子失去一个成键电子的电离过程对应于这一情形。显然，(a)中，IEad=IEv;(b)中，IEad IEv。,电离能（IE）和出现能（AE）对于分子 M 的电离过程，反应(1)的反应热既是该分子的电离能。因此，其中，fH(M+)和 fH(M)分别是 M+和 M 的生成热。,M+e M+2e(1),IE(M)=fH(M+)fH(M),对于分子离子 M+的碎裂过程，反应(2)所需的最低能量称为临界能。在质谱仪中，为了能使反应产生的碎
18、片离子F+能够到达检测器，反应的速度必须足够快。这就要求M+离子的热力学能稍高于反应的临界能。这个能量被称为碎片离子F+的出现能(AE)，其超出反应临界能一部分称为非固定能(E)。(Er+E)=Eex(过剩能量)，是动能释放的来源。,M+F+N(2),AE(F+)=fH(F+)+fH(N)fH(M)+Eex,中性分子的生成热已经积累了较多的数据。因此，通过测定分子的电离能 IE(M)或离子的出现能 AE(F+)，可以得到相关离子的生成热(fH)。注意，为了使测量值足够准确，必须满足以下三个条件：1.除了待测离子外的其他物质的生成热是已知的 2.M+的碎裂反应不存在显著的动能位移(kinetic
19、 shift)3.M+的碎裂反应不存在显著的逆活化能(Er),化学电离(Chemical Ionization)化学电离通过引入大量的试剂气，是样品分子与电子不直接作用。试剂气分子被电子轰击电离后因离子-分子反应产生活性反应离子，这些离子再与样品分子发生离子-分子反应，使样品分子电离。,甲烷作为反应试剂,CH4 质子亲合能(Proton Affinity)PA 543 kJ/mol甘油(Glycerol)PA 874.8 kJ/mol 差值：(874.8-543)kJ/mol=331.8 kJ/mol 3.4 eV(内能),异丁烷作为反应试剂,m/z 58,iso-C4H8 质子亲合能(Pro
20、ton Affinity)PA 802.1 kJ/mol甘油(Glycerol)PA 874.8 kJ/mol 差值：(874.8-802.1)kJ/mol=72.7 kJ/mol 0.75 eV(内能),CI 反应类型,含氨基化合物-用正离子 CI 有利有机酸、醇或含卤素化合物-用负离子 CI 有利,发展趋势：不仅为了获取分子量信息，可用于确定官能团及其位，空间异构体,二次离子质谱(Secondary Ionization)以高能量的初级离子轰击表面，再对由此产生的二次离子进行质谱分析是材料表面分析的一种重要方法。由此基础上发展起来的两种十分相似的电离技术，快原子轰击(FAB)和液体二次离子
21、质谱(LSIMS)在有机质谱中有着重要地位。FAB/LSIMS 离子源：,电喷雾电离(Electrospray ionizatin,ESI),样品,质量分析器,M+nH n+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,1,挥发,裂分,2,1,2,准分子离子,ESI 方法的主要开拓者是 M.Dole 和 J.B.Fenn 等人。ESI 于1989年应用于有机质谱。ESI 的工作原理是：内衬弹性石英管的不锈钢毛细管（内径约 0.1 mm）被加以3 5 kV的正电压，
22、与相距约1 cm 接地的反电极形成强静电场。被分析的样品溶液从毛细管流出时在电场作用和辅助气流的作用下形成高电荷的雾状小液滴；在加热的气体作用下，液滴因溶剂的挥发逐渐缩小，其表面上的电荷密度不断增大。当电荷之间的排斥力足以克服表面张力时，液滴发生裂分，产生带电的更小微滴；这些液滴中溶剂再蒸发，此过程不断重复，直到液滴变得足够小、表面电荷形成的电场足够强，最终把样品离子从液滴中解析出来，形成的样品离子通过锥孔、聚焦透镜进入质谱仪分析器后被检测。,ESI 所能承受的液体流量通常为 1 20 l/min。向喷雾区引入一股逆向的氮气流可以促进雾状液滴的脱溶剂过程。而在内衬的弹性石英管与金属毛细管之间增
23、加一股同轴的助雾化气流可使液体流量提高到 2 ml/min，这样，可使 HPLC与质谱直接联用。另一方面，为了提高灵敏度，采用内径更小的（5 50 m）的毛细管可使液体流量降低至 50 l/min，喷出的液滴直径可由微米级降至纳米级，因而又被称为纳级喷雾（nanospray）。纳级喷雾比常规喷雾的电离效率提高了约两个数量级，检出限可达 10-21 mol/l，尤其适合于具有超高灵敏度和超高分辨本领的 FTICR。电喷雾通常要选择合适的溶剂。除了考虑对样品的溶解能力外，溶剂的极性也须考虑。一般来说，极性溶剂（如甲醇、乙腈、丙酮等）更适合于电喷雾。对于水溶液，由于液体表面张力较大，ESI 要求的阈
24、电位也较高。为了避免高压放电，可向喷雾区引入有效的电子清除剂或使离子源加热以降低表面张力。,ESI 在大气压和环境温度下进行，被分析物的分子在电离过程中通常产生多重质子化的离子。图2.14 是典型的 ESI 质谱图，由一簇不同程度质子化的分子离子峰 组成，相邻两峰相差一个质子。对于任意相邻两峰，由下列公式计算所含的质子数(n)和样品的分子量(M)。,非共价键相互作用,分子间相互作用包括：(1)静电作用(2)氢键作用(3)范德华力作用(4)疏水作用用 ESI(软电离技术)可研究非共价键相互作用ESI 是目前最温和(Soft)的离子化技术,用 ESI 研究非共价键相互作用,用 ESI 研究非共价键
25、相互作用,Anal.Chem.2004,76,211,基质辅助激光解吸电离(Matrix-assist laser desorption/ionizatin,MALDI)通过激光束与固体样品分子的作用是其产生分子离子和具有结构信息的碎片；所研究的是结构较为复杂、不易气化的大分子。采用固体基质以分散被分析样品是 MALDI 技术的主要特色和创新之处。基质的主要作用是作为把能量从激光束传递给样品的中间体。此外，大量过量的基质（基质：样品=10 000：1）使样品得以有效分散，从而减少被分析样品分子间的相互作用。基质的选择主要取决于所采用的激光波长，其次是被分析对象的性质。,基质的作用基质的作用是吸
26、收激光能量并使被测分子分离成单分子状态，使其发生解吸电离。选择基质时，要求样品应能均匀地分散于基质中，基质应能为样品提供质子。较常用的基质有芥子酸、2，5二羟基苯甲酸、2氰基4羟基肉桂酸、3吲哚丙烯酸、蒽三酚等。基质的选择是得到优质谱图的关键。样品制备、基质溶液配制及两者混合后能共同结晶为最好的操作条件，这些因素对灵敏度和分辨率有明显的影响。,Advantages and disadvantages of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization(MALDI),MALDI-TOF-MS可容忍下列物质的最高浓度,MALDI 的应用,蛋白和多肽(Pep
27、tides and Proteins)寡聚核苷酸(Oligonucleotides)碳水化合物(Carbohydrate)合成高分子聚合物(Synthetic polymers)类脂类(Lipids)天然产物(Natural products)(生物碱、甙类、甾类等)合成有机物,胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素(Insulin Human)A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共16种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也
28、存在一个二硫键。,Polymers(e.g.PEG4000-Li),RO(-CH2-CH2-O-)n R,提供的结构信息峰间隔为 44 表明：聚合物的重复单元为(-CH2-CH2-O-)n,C112H128N16O16Zn4MW=2208,金属有机化合物,Angew.Chem.Int.Ed.2003,42,3271-3274.,基质：咔啉溶剂：CH3Cl,基质：咔啉溶剂：CH3Cl,C56H64N8O8Zn2MW=1284.43,质量分析器,电磁扇型双聚焦质谱仪飞行时间质谱仪四极杆质谱仪离子阱质谱仪离子回旋共振质谱仪,磁质谱仪磁质谱仪分为单聚焦和双聚焦两种。单聚焦质谱仪只有一个磁场；双聚焦质谱
29、仪除了磁场外，还有一个静电场。双聚焦质谱仪中静电场和磁场的放置顺序有两种形式：（1）顺置形式，即静电场在前面，磁场在后面；（2）反置形式，即磁场在前面，静电场在后面。反置形式除了与顺置形式有相同的功能外，还具有一些独特的功能(可做MIKE谱)，该构型是最重要的质谱/质谱串联结构之一。,（1）扇形磁场和电场在离子源中被加速的离子垂直射入扇形磁场中，在洛仑兹力作用下作圆周运动(如图示)，所受到的向心力和离心力平衡。所以，结合(1)、(2)式得出：其中，B和r 分别是磁场强度和离子运动轨道半径。,(3)式表明，磁场是质量分析器。当 r 固定后，离子的质荷比(m/z)与磁场强度平方成正比，而与加速电压
30、成反比。若将Vacc固定，扫描磁场则可检测出样品中不同 m/z 的离子。将离子垂直射入由一对半径分别为 r1 和 r2 的同轴扇形柱面电极组成的静电场中，离子作半径为 re 的圆周运动，受到的电场力与离心力平衡。所以，,将(1)式代入上式，得：式中，E 为电场强度。当此值一定时，加速电压的改变将导致离子的运动轨道半径的改变。因此，电场是能量分析器。在双聚焦仪器中，电场 E 与加速电压维持一定的比例关系。调整E 使之与加速电压匹配，可使在离子源中产生的所有离子通过并被检测。对于亚稳离子在无场区产生的碎片离子，可通过扫描电场 E 检测到（以后将涉及到）。,定义：有两个高度相等，质量分别为 M1 和
31、M2 的峰正好分开，则质谱仪的分辨本领定义为：严格地讲，式中 M=(M1+M2)/2,M=M2-M1。对于磁质谱来说，所谓正好分开就是按照国际上统一规定10谷的定义：两峰重叠后形成的谷高为峰高的10时，认为这两峰正好分开。,磁质谱分辨率定义（10%谷）,高分辨质谱的优点,四极杆与离子肼质谱仪四极杆质谱仪的分析器称四极质量分析器（Quadrupole mass analyzer）。其工作原理与扇形磁场截然不同，扇形磁场靠离子动量的差别而把不同质荷比的离子分开，而四极质量分析器是靠质荷比不同把离子分开，因而，四极质量分析器又称四极滤质器。离子在四极质量分析器中运动，其运动方程及其求解都较复杂。这里
32、仅就其工作原理简述如下。四极分析器由四根平行电极组成。在一对电极上加电压 U+V cost，另一对加上电压(U+V cost)。其中,U 是直流电压,Vcost 是射频电压。由此形成一个四极场。,四极杆质量分析器,由一组平行放置的四根金属棒构成,用陶瓷绝缘,交错地联结成两对；加以方向相反的直流(DC)和射频(RF)电压；加速粒子进入分析器,并按m/z和RF/DC值开始以一种复杂的形式振荡,稳定振荡的离子通过打拿极射到倍增器上被放大记录,不稳定振荡的离子打到四极杆上被中和,从而达到质量分离目的.,当质荷比为 m/e 的离子沿 z 轴射入四极场时，其运动方程为：,这是典型的 Mathieu 方程，
33、其解十分复杂，所代表的物理意义可由以 a、q 为坐标的曲线表示。a、q 值在稳定区内的离子产生稳定振荡，顺利通过四极场到达检测器；a、q 值在非稳定区的离子因产生不稳定振荡而被电极中和。,当一组质荷比不同的离子进入由 DC 和 RF 组成的电场时，只有满足特定条件的离子作稳定振动通过四极杆，到达检测器。其他离子均作不稳定振动而与四极杆相撞，不能通过四极杆。图17为四极质量分析器分别分析 m/z=100,10,1000 时的截面图。特别要说明的是三个例子都是在 DC 和 RF 组成的电场完全相同的情况下进行的，但只有 m/z=100 的离子能够跑完全程到达检测器，其它离子都被滤掉了。所以，质谱图
34、能够通过扫描 RF 场而获得。,对于一台四极质谱仪，其场半径 r 为固定值，也选为定值。若以 a/q=U/V=常数 对 V 进行扫描，可使一组不同质量的离子先后进入稳定区而被检测。显然，a/q 比值越大（扫描成的斜率越大），在扫描线上稳定区内的质量范围越窄，仪器的分辨率越高。四极分析器可以自身串联，构成串联质谱仪，如 Q1，q，Q2。其中，q 是一个只有射频电压的碰撞室，Q1 和 Q2 是两个分析器。它还可以与其它质量分析器串联，构成杂化型串联质谱仪，以综合利用各种分析器的特点。,离子阱质谱仪的分析器是由一对环形电极（ring electrode）和两个呈双曲面形的端电极（end cap el
35、ectrode）组成。在环形电极上加射频电压或再加直流电压，上、下端盖电极接地，如图示。离子肼中心至上下端电极距离为Z，至环电极内侧为r。,离子肼中离子的运动，可以由 Mathieu 方程给出：式中各物理量的含义分别由下式给出：,Mathieu 参数 a 和 q 很重要，它们决定了离子运动是否稳定。可以用 az 和 qz 为坐标的稳定性图来表示：,图中，有若干相互交叉的曲线，称为等线。从左到右的曲线是从0 1的等 z 线；从上到下的曲线则是从0 1的等 r 线。处于稳定区的离子，即是 r,z=0 1 的区域。处于此区域的离子，在 r 方向或 z 方向的运动振幅均不大，能长期贮存于离子肼中；稳定
36、区周域以外是不稳定区，处在不稳定区的离子，由于在r 方向或 z 方向的运动振幅过大，会与环电极或端电极碰撞而导致消亡。上图中的 m1、m2 和 m3 分别表示三种离子在质量选择喷射时的（az,qz）坐标：m1 表示已经喷射出去并被检测的离子；m2 表示正好处在喷射口的离子；m3 表示仍然留在肼中的离子。当 U=0,即此时不加直流电压。由 qz 的表达公式及上图可知，固定的射频，当逐渐增加 V 时，qz 会随之增加。一旦到达qz=0.908（即图中m2 所在位置所对应的qz 值）时，离子进入不稳定区，由端盖电极上的小孔排出。因此，当V逐渐增高时，质荷比从小到大的离子逐次排出并被记录而获得质谱图。
37、这就是离子肼进行质量扫描的原理。,除此之外，离子阱还可以贮存离子。当不加直流电压时，qz 0.908 的离子均贮于离子阱内。可根据需要选择感兴趣的某一质荷比的离子贮存于离子阱内，进行时间上的 MSn 操作。四极离子肼可直接在肼中使样品电离，也可使用外部离子源。前者是在一个端电极上置一微孔，灯丝发射的电子由此进入阱中使样品分子电离；后者将在离子源中产生的离子注入肼中进行分析。采用外部离子源可使四极离子阱在分析上得到更广泛的应用。例如，采用ESI电离源，离子阱可与 HPLC 联用，用于生物大分子的结构研究。,飞行时间质谱仪（Time-of-flight,TOF）飞行时间质谱仪始于20世纪40年代，
38、但由于当时电子技术和仪器设计的落后，仪器分辨率很低，很难推广使用。到80年代末，Hillenkamp 等发明了基质辅助激光解吸电离的新方法之后，将这新的电离方法与飞行时间质谱组合成一种新型仪器基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱（MALDI/TOF），使飞行时间质谱的应用迈进了一个崭新的时代，把测定分子量的范围扩展到几十万原子质量单位（u）。在一般情况下，MALDI/TOF MS 的灵敏度达到10-15 mol 量级，准确度达到 0.1%0.01%的水平，因而，飞行时间质谱仪便成为生命科学领域中重要分析工具，在多肽、蛋白质、糖、核苷酸、高聚物的分析中得到广泛应用。C60 及其衍生物、稀土元素络合
39、物、金属络合物及某些挥发性很低非极性及分子量较大的有机化合物，用有机质谱测试很难得到信号，而用MALDI/TOF-MS 测试，则可以得到非常理想的谱图。,飞行时间质谱分线性及反射模式两类。经典的线性飞行时间质谱包括EI电离源、圆筒式飞行管、检测器和记录系统三部分。性能较好的商品仪器既有线性模式也具有反射模式，其装备简图如图示。,飞行时间质量分析器,飞行时间质谱仪的工作原理：在离子源中产生的离子经电压 Vacc 加速后获得的速度为：经过长度为 L 的漂移管到达检测器，离子的飞行需要的时间：可以看出，质荷比大的离子飞行速度越小，到达检测器的时间也越长，质荷比小的离子先到达检测器。在通常情况下，离子
40、的飞行时间为微秒数量级。,飞行时间质谱首先要考虑的问题是如何使离子在被注入漂移区后既无空间发散又无能量发散。如果相同质量的离子在不同时间离开离子源或存在能量发散，分辨率将大为下降。解决办法之一是采用离子反射技术，使不同动能的离子得到聚焦。如图示，在经过漂移管后，离子进入减速反射区；动能较大的离子在该区中进入较深（存在运动惯性），反射过来所需的时间也较长，这使动能较小的离子可以赶上。因此，经过反射，质量相同而动量不同的离子可以同时到达检测器。,Principle of MALDI-TOF,2.Energy Focussing by the Reflectron,m1=m2,E1 E2,飞行时间质
41、谱仪分辨率的定义定义：其中，M 是拟确定的质量，M 是半峰高时的峰宽。线性模式，分辨率较低；反射模式，分辨率较高，可高达 15,000。,傅立叶变换离子回旋共振质谱仪（FT-ICR-MS）傅立叶变换离子回旋共振质谱仪的分析器是由一对激发电极、一对检测电极和一对收集电极组成的池子（cell），置于稳定的超导磁场中，磁场垂直于收集电极。,在磁场中，分析池内的离子会在垂直于磁场的平面中做回旋运动，各种离子的回旋运动频率为：,假设在激发电极上加一个高频电信号，其频率与某一个质荷比离子的回旋运动频率一致，则这个离子将吸收高频电信号的能量，因而这个离子的运动速度加快，回旋运动的半径逐渐加大（图1-12）。
42、停止高频电信号后，该离子将以较大的固定半径作回旋运动，由于该离子离检测电极较近，因而检测电极被感应而产生高频电信号（下页图）。这个信号被检测，其频率和该离子的回旋运动频率相一致，由公式（1）就可计算出该离子的质量。,但必须指出，由于FTICR-MS 是用特定波形的高频电场，把共振池中某段质量范围的离子同时激发到回旋运动轨道上，并以各自的回旋频率作运动，因此，在检测电极上感应出不只一种频率电信号，而是多种频率电信号的叠加。必须再用傅立叶变换技术，快速将时域谱变换成频域谱。按公式（1），可以由频率换算成质量数，从而获得各个离子的质量及其丰度，即常见的质谱图。,Basic experimental
43、sequence for FTMS,FTICR-MS 的分辨率定义 分辨率通常是商品仪器的主要性能指标，但不同种类仪器，分辨率定义涵义有所不同，FTICR-MS 的分辨率（Full Width at Half Height，FWHH）按下式定义：其中，m 某一离子的质量，m 半峰高的峰宽。,图 1-15 是 EI 条件下，测定全氟三丁胺（PFTBA）的 m/z 131 峰的分辨率高达 100 多万。其中，m0.00012 Da,高分辨 ESI 谱图,高分辨离子回旋共振质谱仪(ICRMS)能把多电荷离子的同位素峰分开，从而容易确定各个峰的电荷数,Human Growth Hormon(intac
44、t):FTMS Spectrum,FTICR-MS 的特点超高分辨高测量准确度可以实现时间串联MSn可以在池内进行离子分子反应等,1.2 离子结构的确定,串联质谱是通过对选定m/z离子反应产物的分析，对目标化合物进行结构鉴定或断裂机理等方面的研究。此法不须预先色谱分离,适合复杂混合物体系分析。,1.2.1 串联质谱基础,二级串联质谱（以 MS/MS 或 MS2 表示）,若要深入了解离子（包括分子离子和碎片离子）的性质及其反应机理，仅仅取得常规质谱数据是远远不够的，须结合串联质谱技术得到进一步的结构信息。M+和 F+离子的分解反应通常都有许多竞争的反应通道。因此，常规质谱记录的是所有这些连续和平
45、行反应的总和。,串联质谱与色谱/质谱这两种技术的相似性：串联质谱通常用 MS/MS 或者 MSn 表示。质谱仪一般只能作纯物质的定性分析，对于混合物样品，需要采用GC/MS 或 LC/MS。然而，MS/MS 装置可以在某种范围内进行混合物的直接分析。,串联质谱 A.空间串联 B.时间串联,时间串联质谱仪 是用同一个质量分析器在不同时间进行串联质谱实验，如：FT-ICR（傅里叶离子回旋共振）和 IT（离子阱）。这两种仪器的工作原理并不相同，但进行 MS/MS 实验的程序颇为相似，都包括以下步骤：电离、选择离子、激发前体离子、最后检测产物离子。,亚稳离子动能谱(Mass-analysed ion
46、kinetic energy spectrometry,MIKES or MI)&1.2.3 碰撞诱导解离谱(Collisionally-induced dissociation,CID),P+F+N 前体离子 碎片离子 中性碎片亚稳反应：前体离子 P+不与任何粒子（包括中性分子、离子、电子或光子等）进行能量交换，属单分子过程，被称为亚稳离子（Metastable Ion，MI）的解离反应。在观察亚稳反应时，发生反应的场所必须处于严格的高真空状态。一般来说，亚稳离子的碎裂反应通道相对较少，只有那些活化能较低的才能被观察到。碰撞诱导解离反应：前体离子 P+被活化后发生的分解反应，称为碰撞诱导解离
47、反应（Collision-induced Dissociation）。最常用的离子的活化方式是向反应区内引入一种惰性气体，使其与离子发生碰撞。在这个过程中，离子的部分动能被转变为内能，然后再发生单分子分解。通常碰撞诱导解离反应可以获得更多的反应信息。,P+N P+*F+N,离子的活化还可以通过与（激光）光子或电子束的作用来实现，并被称为光致解离（photodissociation，PD）和电子轰击激发（electron impact excitation of Ions of organics，EIEIO）另一种较为特殊的方式是使离子直接碰撞到固体表面上。这种技术被称为表面诱导解离（surfa
48、ce-induced dissociation，SID）。亚稳谱 和 碰撞诱导解离谱 是最常用也是最重要的串联质谱方法。对于感兴趣的离子，同时获得其亚稳谱和碰撞诱导解离谱是很有意义的。通过比较这两种谱，通常可以得到有关不同反应通道活化能相对大小的信息。,反置双聚焦质谱仪（VBE系统）是最具代表性的串联质谱系统。用磁场 B 将感兴趣的离子选择出来，第二无场区中反应的产物离子由静电场 E 分析。,例如，P+是我们感兴趣的离子。首先，选择适当的磁场强度将 M+选择出来，研究 P+的反应。由上式可以看出，P+产生碎片离子 F+。注意：F+是在 P+离开离子源后，也就是在飞行过程中产生的，所以它仍然保持
49、前体离子 M+的运动速度，即它们的动能与其质量成正比。因为静电场是离子的动能分析器，所以扫描静电场便可得到 M+的所有产物离子。当反应是没有靶气时(即在亚稳方式)，这种技术被称为质量分析离子动能谱(MIKES)；有靶气时，称为碰撞诱导解离谱(CID)。,几个基本概念,1.离子的飞行时间及寿命 在通常使用的 EI 质谱条件下，离子在离子源中停留大约为 15 s。当离子离开离子源经加速电压加速后，其运动速度为 根据公式(1)：进入磁场和电场，离子的运动方向虽然发生偏转，但其速度不变。离子经过一定距离 L 到达检测器。所需要的时间 t 可通过下式计算：,例如，一台双聚焦质谱仪，从离子源出口到检测器的
50、距离为2 m、质量为100 u 的一价离子经 8 kV的加速电压加速后到达检测器所需要的时间是多少？,提示：1 u=1 Da=1.6610-27 kg;1eV=1.610-19 J,离子到达第二无场区所需的时间约为这个时间的一半。在与此相似的仪器参数下，质谱中的反应在10 s 这个量级的时间内完成。,亚稳离子亚稳离子隐含着分子离子与碎片离子、或碎片离子与碎片离子之间的亲缘关系。测定亚稳离子可对质谱解释、质谱碎裂机理研究及分子结构、离子结构的确定，提供可靠的、确定的实验依据。双聚焦质谱仪，在 EI 操作条件下，70eV电子轰击样品，样品分子将产生分子离子M+，这些分子离子具有范围很宽的内能（或热
