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1、1 核酸的结构与功能,1.1 核酸的种类分布和化学组成1.2 核酸的分子结构1.3 核酸的理化性质及其应用,1.1 核酸的种类、分布及化学组成,1.1.1 核酸的生物学功能1.1.2 核酸的种类和分布1.1.3 核酸的组成,核酸是遗传变异的物质基础,核酸是生物体内最重要的生物大分子，是一种富含磷酸基团的高分子化合物。任何生物 体，甚至无细胞结构的病毒和噬菌体都含有核酸。核酸在生物的个体发育、生长繁殖、遗传变异等生命过程中起着极为重要的作用。而且它与生命的异常活动如肿瘤的发生，辐射损伤，遗传病，代谢病等密切相关。,核酸的发现,186869F.Miescher从脓细胞核中提出含磷量高的核素（nuc
2、lein），其后从鲑鱼精子中提取出鱼精蛋白和核素。1889年，Altman等从酵母和动物的细胞核中得到了不含蛋白质的称为核酸(nucleic acids)的物质，其功能不清楚。1944年O.T.Avery等的肺炎双球菌转化实验，证明了DNA就是遗传物质。,1.1.1核酸的生物学功能,DNA作为遗传物质的载体，负责遗传信息的储存、传递和发布；RNA负责遗传信息的表达。细胞 内DNA含量很稳定，不受营养条件、年龄等因素的影响。DNA是染色体的主要成分，而染色体与遗传直接有关。可作用于DNA的一些物理、化学因素都可以引起遗传特性的改变。,肺炎双球菌的转化实验,1952年A.D.Hershey和M.C
3、ha-se用35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和DNA部分，感染大肠杆菌的实验进一步证明了DNA是遗传物质。,1.1.2 核酸的种类和分布核酸主要存在于细胞核中(原核分布在类核)，由几千至几万个核苷酸(nucleotide)连接成的无分支长链高分子化合物也称多聚核苷酸(polynucleotide)。核酸根据核酸的化学组成和生物学功能，将核酸分为：核糖核酸（ribonucleic acid RNA）和 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid DNA),所有细胞都同时含有DNA和RNA两种核酸。病毒只含一种核酸，DNA或RNA，故有DNA病毒和RNA病毒之分。多数细菌病毒
4、（噬菌体）属DNA病毒，而植物和动物病毒多为RNA病毒。,DNA：主要存在于细胞核（真核细胞，98%以上），是染色质的主要成分；原核生物DNA主要存在于类核（nucleoid）中；在核外也存在有少量DNA，如线粒体DNA、叶绿体DNA以及细菌的质粒（plasmid，细菌染色体外能够进行自我复制的遗传单位）。,RNA的种类与分布,RNA主要存在于细胞质中。mRNA 约占细胞总RNA的5%，在蛋白质合成中起模板作用 rRNA 占细胞总RNA的80%，是核糖体的组分，是合成蛋白质的场所tRNA 占细胞总RNA的10-15%，蛋白质合成中起携带活化氨基酸的作用,1.1.3 核酸的化学组成核酸核苷酸核苷
5、 磷酸碱基（嘌呤和嘧啶）核糖或脱氧核糖（戊糖）,核酸是由核苷酸组成的，核苷酸是核苷的磷酸酯，核苷由碱基和核糖/脱氧核糖组成，碱基有嘌呤和嘧啶两类。DNA组成：脱氧核糖、磷酸、A、G、C、TRNA组成：核 糖、磷酸、A、G、C、U,1.1.3.1 核糖和脱氧核糖RNA中的戊糖为-D-核糖，和少量的-D-2O-甲基核糖；DNA中的戊糖为-D-2-脱氧核糖。戊糖C-1所连的羟基与碱基形成糖苷键，糖苷键的连接都是-构型。戊糖的碳原子编号都加上“”，以区别于碱基的原子编号。,1.1.3.2 碱基(base)嘧啶(pyrimidine)：胞嘧啶(cytosine，C)、胸腺嘧啶（thymine，T)、尿嘧
6、啶(uracil，U)；嘌呤(purine)：腺嘌呤(adenine，A)、鸟嘌呤(guanine，G)；DNA中存在：A、T、G、C；RNA中存在：A、U、G、C。,核酸分子中含有一些稀有碱基(或修饰碱基)：是五种碱基环上的某一位置被一些化学基团（如甲基化、甲硫基化等）修饰后的衍生物。如：5-甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤等。稀有碱基在核酸中的含量少，分布也不均一。如DNA中的修饰碱基主要见于噬菌体DNA，RNA中以tRNA含修饰碱基最多。,1.1.3.3 核苷戊糖与碱基缩合形成核苷，并以糖苷键连接。嘌呤环上的N-9或嘧啶环上的N-1与戊糖的C1上的-OH形成N-C糖苷键。X-衍射证明核苷中的
7、碱基与糖环平面相互垂直。,核酸中的主要核苷有8种。,1.1.3.4 核苷酸和稀有核苷酸核苷酸(nucleotide)是核苷的磷酸酯。核苷酸的核糖有3个自由羟基，可以酯化分别生成2-、3-和5-核苷酸。脱氧核苷只能生成3-和5-脱氧核苷酸。生物体内多为5-核苷酸。,稀有核苷酸：核酸中的稀有核苷酸是碱基或戊糖被修饰后形成的。核酸中的稀有核苷酸常以其核苷的形式表示。常见的为甲基化修饰以“m”（methy-）表示，修饰基团在碱基上的写在碱基符号的左方，修饰基团在戊糖上的写在碱基符号的右方，修饰基团个数写在其右下角，修饰位置写在右上角。,2-O-甲基腺苷,1.1.3.5细胞内的游离核苷酸及其衍生物,细胞
8、中还有一些游离的核苷酸及其衍生物，其中较重要的为多磷酸核苷酸、环式单核苷酸和辅酶类单核苷酸。,根据多磷酸核苷酸中磷酸数目可分为单磷酸核苷酸、二磷酸核苷酸和三磷酸核苷酸，如AMP、ADP和ATP。,环化核苷酸：cAMP和cGMP在细胞的代谢调节中有重要作用，称为第二信使。,辅酶类核苷酸：NAD、NADP、FMN、辅酶A和FAD等辅酶都是核苷酸或其衍生物。,1.2 核酸的分子结构1.2.1 DNA的分子结构1.2.1.1 DNA的一级结构DNA的一级结构指的是组成DNA分子的脱氧核苷酸的连接方式和排列顺序。DNA是由很多个dAMP、dGMP、dCMP和dTMP通过3,5-磷酸二酯键连成的无分支双链
9、线状或环状多核苷酸。E.coli DNA 4106bp，1.4 106nm；人DNA 2.9 109bp 9.9 108nm,DNA一级结构,核酸为多聚核苷酸,相邻2个核苷酸间以3,5-磷酸二酯键连接。,核酸分子的表示方法DNA分子中链骨架是固定不变的，脱氧核糖核苷酸的排列顺序实质上是碱基的排列顺序。核酸链的简写式：核酸分子的简写式可简明表示高度复杂的核酸分子。简写式表示的是核酸分子的一级结构，即核酸分子中的核苷酸（或碱基）排列顺序。书写方式由5 3 端。nt（nucleotide），代表核苷酸 bp（base pair），代表碱基对。,线条式：以竖线和斜线分别表示糖基和磷酸酯键。,糖基的C-
10、3位,糖基的C-5位,字符式：用A、T、G、C、U代表碱基，用P代表磷酸残基。核酸分子中的糖基、糖苷键和酯键等均省略不写，将碱基和磷酸相间排列即可。省略了糖基，简写式中出现T的为DNA链，出现U则为RNA链。以5和3表示链的末端及方向，分别置于简写式的左右二端。5pApCpTpTpGpApApCpG3 DNA5pApCpUpUpGpApApCpC3 RNA,简化为：5pACTTGAACG3 DNA5pACUUGAACG3RNA简写式的5-末端均含有一个磷酸残基（与糖基的C-5位上的羟基相连），3-末端含有一个自由羟基（与糖基的C-3位相连），若5端不写P，则表示5-末端为自由羟基。,Sange
11、r测序原理,1.2.1.2 DNA的二级结构及其多态性Watson和Crick在总结前人研究工作的基础上，在1953年以立体化学上的最适构型建立了与DNA X-射线衍射资料相符的分子模型DNA双螺旋结构模型。它可在分子水平上阐述遗传(基因复制)的基本特征。,DNA双螺旋结构的主要依据1949-1951年Chatgaff应用紫外分光光度法和纸层析等技术，对不同来源的DNA进行碱基定量分析，得出组成DNA四种碱基的比例关系。,不同来源DNA碱基组成的比例关系,碱基组成的共同规律：不同来源的DNA中A=T、C=G；A+G=T+C。,Wilkins及其同事Franklin等用X-射线衍射方法获得的DN
12、A结构资料。用电位滴定法证明DNA的磷酸基可以滴定，而嘌呤和嘧啶的-NH、-CO则不能滴定，因此它们之间形成氢键。Norweger,Furberg研究证实，戊糖糖环与DNA分子纵轴平行，而碱基平面与纵轴垂直。,（2）双螺旋结构模型DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链构成右手双螺旋结构。螺旋表面有一条大沟和一条小沟。大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。小沟位于双螺旋的互补链之间，而大沟位于相毗邻的双股之间。,一条多核苷酸链上的嘌呤碱基与另一条多核苷酸链上的嘧啶碱基以氢键相连，配对原则是A=T，C G。碱基层叠于螺旋内侧，碱基平面与纵轴垂直，碱基之间距离为0.34nm。磷酸和脱氧
13、核糖在外侧，彼此之间通过磷酸二酯键连接。糖环平面与中轴平行。螺旋直径2nm；螺旋周期包含10bp；螺距3.4nm；相邻碱基对平面的间距0.34nm。,双螺旋结构的稳定因素DNA结构稳定的最主要因素是碱基堆积力。层层堆积的芳香族碱基上的电子云交错形成了碱基堆积力，使DNA双螺旋结构内部形成疏水核心而不存在游离的水分子，有利于互补碱基间形成氢键；双螺旋外侧带负电荷的磷酸基团同带正电荷的阳离子之间形成的离子键可减少双链间的静电斥力，因而对DNA双螺旋结构也有一定的稳定作用。,（4）DNA双螺旋构象的多态性在多核苷酸链中，戊糖能折叠成多种构象，同时，分子还可绕C-N糖苷键以及3,5-磷酸二酯键旋转一定
14、角度，使得具有同样碱基配对的DNA双螺旋可以采取不同的构象，这种构象上的差异称为多态性。在溶液中，DNA一般为B型。在以钠、钾或铯作反离子，相对湿度为75时，DNA分子的X-射线衍射图显示的是A-构象。A-构象不仅出现于脱水DNA中，还出现在RNA分子中的双螺旋区和DNA-RNA杂交分子中。,B-DNA与A-DNA的比较,Z-DNAWang和Rich等在研究人工合成的d（CGCGCG）单晶的X-射线衍射图谱时，发现这种六聚体的构象不同于B-构象。它是左手双螺旋，在主链中各个磷酸根呈锯齿（Zigzag）状排列，因此称Z-构象。,B-DNA与Z-DNA的比较,天然DNA分子中存在有Z-DNA区。B
15、-DNA与Z-DNA的互变可能与基因的调控有关。如胞嘧啶C5的甲基化，在甲基周围形成局部的疏水区。这一区域扩伸到B-DNA的大沟中，使B-DNA不稳定而转变为Z-DNA。这种C5甲基化现象在真核生物中是常见的。,利用X-射线衍射技术时的样品分析条件与被测DNA分子的天然状态相差甚远，在反映DNA结构真实性方面这种方法存在着缺陷。1989年，应用扫描隧道显微镜(STM)可克服X-射线衍射技术的缺陷（分辨率10-10m）。STM可将被测物放大500万倍，且能直接观测接近天然条件下单个DNA分子的结构细节。它所取得的DNA结构资料更具有“权威性”。STM证实了d(CG)重复序列的寡核苷酸片段为Z-D
16、NA结构的事实。,（5）三链DNA（H-DNA）在三链DNA中，polyPy和polyPu形成反向平行的双螺旋，碱基以Watson-Crick方式配对，第三股链则以结合于大沟中。在三链DNA中，位于大沟中的多聚嘧啶链与双链DNA中的多聚嘌呤链成平行走向，碱基按照Hoogsteen方式配对形成TAT，CGC三联体。作用：与基因表达调控有关，第三股链可能阻碍一些调控蛋白或RNA聚合酶与DNA结合。,1.2.1.3 DNA的三级结构,在二级结构基础上形成的整条DNA分子的空间结构.(超螺旋结构,核小体结构),(1)超螺旋结构的形成DNA双螺旋结构中，一般每转一圈有10个核苷酸对，平时，双螺旋总处于能
17、量最低状态。若正常DNA双螺旋额外地多转或少转几圈，使每一圈的核苷酸数目大于或小于10，就会出现双螺旋空间结构的改变，在DNA分子中产生额外张力。若此时双螺旋的末端是固定的或是环状分子，双链不能自由转动，额外的张力不能释放，导致DNA分子内部原子空位置的重排，造成扭曲，出现超螺旋。,超螺旋有正超螺旋和负超螺旋负超螺旋：形成超螺旋时，旋转方向与DNA双螺旋方向相反，称为松旋效应。在自然条件下共价封闭环状DNA呈负超螺旋结构。正超螺旋：与负超螺旋相反，形成超螺旋时的旋转方向与DNA双螺旋方向相同，有紧旋效应。,L:Linking numberT:twisting numberW:writhing
18、number,真核生物DNA的包装DNA是生物大分子，人单倍体细胞基因组含有3109bp，一条染色体包含一条DNA双链分子，若将所有染色体(双倍体细胞)相连并充分伸展，长度达2m左右。巨大的DNA链必需高度压缩形成一定的高级结构，才能贮存于小小的细胞核中。,核小体（nucleosome）是染色体的基本结构单位核小体由核心颗粒(core particle)和连接区DNA(linker DNA)组成。,染色质基本单位的核小体。由核小体螺旋化盘绕形成螺线管。由螺线管纤维缠绕形成染色质纤维环。由染色质纤维环会再绕成螺旋形成染色体。,1.2.2 RNA的分子结构RNA的一级结构为线形多聚核苷酸，核苷酸间
19、也是3,5-磷酸二酯键连接，与 DNA 不同之处是戊糖为核糖，碱基中T变为U。天然的RNA一般都为单链，但单链回折时通过碱基配对（A=U，GC）形成部分双螺旋区，称为发夹，以碱基堆积力和氢键维持。,1.2.2.1t RNA（transfer RNA，转移RNA）tRNA由7090个核苷酸组成，分子量为2500030000dalton，沉降系数4S，含较多的稀有碱基（修饰碱基），种类多。tRNA的作用是携带活化氨基酸参与蛋白质合成。,tRNA的二级结构不同的tRNA具有相似的高级结构，tRNA分子单股链通过自身折叠形成四个螺旋区和四个环的基本结构，类似一个三叶草，称为三叶草结构(cloverle
20、af structure)。,tRNA分子中含有氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环和TC环五部分。,氨基酸臂：7bp组成，富含G，5-pG或pC，3-CCA-OH，氨基酸连接在腺苷酸残基(A)上。TC环：由7个碱基组成，参与tRNA与核糖体表面的结合。额外环或可变环(extro variable loop)。碱基种类和数量（318个碱基）高度可变，并富含稀有碱基。环的大小与生物种类有关，作为tRNA分类的指标。反密码子环(anti-cordon loop)。由7个碱基组成，处于中间位的3个碱基为反密码子，常含有次黄嘌呤核苷酸。反密码子可与mRNA中的密码子结合。二氢尿嘧啶环(D-loop
21、)由812个碱基组成，具2个二氢尿嘧啶(DHU)。,tRNA的三级结构tRNA的三维结构(three dimensional structure)是倒“L”形。,1.2.2.2 rRNA（ribosomal RNA）rRNA分子量为103106D，存在于核糖体(ribosome)中。原核生物大肠杆菌的rRNA有5S、16S和23SrRNA三种，动物细胞有5S、5.8S、18S和28S rRNA四种。,1.2.2.3 m RNA（messenger RNA）mRNA是蛋白质生物合成的模板（template），它携带着从DNA分子中抄录而来的指令多肽链中氨基酸排列顺序的信息，是遗传信息的传递者，故
22、称之为信使RNA。每一种蛋白质都是由一种特定的mRNA编码，故细胞内mRNA种类很多，但每一种mRNA的数量却很少（5%以下），瞬时含量低，代谢率高。分子大小差异很大。,mRNA的结构典型的真核mRNA的结构顺序是：帽子结构区-5非编码区-起始密码-编码-终止密码-3非编码区-polyA尾巴真核生物mRNA一级结构特点：5 3 5帽子 5非翻译区 翻译区 3非翻译区 polyA尾,原核生物mRNA一般为多顺反子(polycistron)，即在同一mRNA中含有编码多个蛋白质的信息(一个基因即一个顺反子)；真核mRNA通常是单顺反子，一 个mRNA只能编码一条多肽链。,原核生物的多顺反子,真核生
23、物的单顺反子,原核细胞mRNA的结构特点,真核细胞mRNA的结构特点,真核和原核mRNA都是单链线状分子，内部有许多碱基互补区，mRNA回折时可形成大量发夹结构。真核mRNA的5-端的帽子结构-m7GpppNm结构“帽子”结构通常有m7G5ppp5Np、m7G5ppp5Nmp和m7G5ppp5NmpNmp三种类型。,真核生物帽子结构的复杂程度与生物进化程度关系密切。mRNA 5-端帽子结构是mRNA翻译起始的必要结构，对核糖体对mRNA的识别提供了信号；这种帽子结构还可能增加mRNA的稳定性，保护mRNA 免遭5 3核酸外切酶的攻击，同时也与mRNA的翻译活性有关。,绝大多数真核mRNA的3-
24、末端有一段长约200个残基的Poly（A）。原核生物mRNA一般无此结构。Poly（A）尾巴是转录后在核内加上的。,Poly（A）尾巴的功能可能与mRNA从细胞核转送到细胞质有关。但是相当数量的没有polyA尾巴的mRNA如组蛋白mRNA，也能通过核膜进入细胞质。这种结构可能对真核mRNA的翻译效率具有某种作用，使mRNA较容易被核糖体辨认，并能稳定mRNA结构，保持一定的生物半衰期。,1.3 核酸的理化性质及其应用1.3.1 核酸的一般性质(1).RNA为白色粉末状，DNA是白色纤维状固体，二者均溶于水，而不溶于一般有机溶剂中，故常用冷乙醇从水溶液中将核酸沉淀出来。,(2).大多数DNA为线
25、性分子，长度可达数厘米，直径仅为2nm，故DNA溶液粘度很高，分子极易断裂；RNA溶液粘度较小。,核酸电泳,利用带电离子在电场中的运动对物质进行分析.,碱解,(3).核酸可被酸、碱或酶水解，DNA比RNA稀碱稳定。,(4).核酸是两性电解质，但酸性强，与金属离子结合成盐，也可与碱性蛋白（组蛋白）结合；介质pH大于4时，呈阴离子，电泳时向阳极移动；DNA在pH411间最稳定，超出此范围易变性。,1534 bp 994 bp 695 bp 515 bp 377 bp 237 bp,1.3.2 核酸紫外吸收核酸分子中的嘌呤和嘧啶碱基中含有共轭双键体系，因而具有特殊的紫外吸收光谱，其最大吸收峰位于26
26、0nm处。利用这一性质可定量测定核酸的含量或鉴定核酸的纯度。样品中如含有蛋白质及苯酚等杂质，此比值明显降低。纯DNA：OD260/OD280=1.8 纯RNA：OD260/OD280=2.0,DNA的减色效应：(复性过程)有规律的双螺旋结构的DNA分子的光吸收值比无序松散状态的分子的吸收值低。,1.3.3 核酸的变性和复性1.3.3.1 核酸的变性（denaturation）概念核酸的变性是指因某些理化因素的影响使维持核酸空间结构的氢键和疏水键断裂，双螺旋结构解体，但不涉及核 苷酸间共价键的断裂。核酸变性后，粘度降低，紫外吸收值增高(增色效应)，生物功能消失。,影响变性的因素破坏双螺旋稳定性的
27、因素都可使DNA变性。DNA分子中的碱基处于配对和不配对的动态平衡状态，很多因素会引起它向不配对方向转变，即引起DNA变性。如高温、强酸、强碱、有机溶剂(乙醇、丙酮等)、尿素、酰胺等试剂、射线等。,高温：DNA稀盐溶液加热到80100，几分钟内双螺旋键即解开，形成无规则的线团。离子强度：提高溶液的离子强度，可中和DNA分子链上磷酸基团的负电荷，降低它们之间的排斥力，稳定DNA的结构。DNA通常保存在1molNaCl中。极端的pH值：pH1时，DNA的磷酸二酯键会被水解；pH11.3时，DNA的所有氢键断裂。疏水作用：甲醇可增加碱基的溶解度，三氟醋酸钠可降低DNA分子的疏水作用，破坏双螺旋结构引
28、起变性。,DNA的熔点（Tm）DNA的热变性过程中光吸收达到最大吸收一半时的温度称为DNA的解链温度(melting temperature，简写Tm)或熔点，用 Tm 表示。DNA的Tm值一般在7085之间。热变性是在很狭的温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时的熔化现象，故名熔解温度。,（4）Tm的影响因素DNA的均一性高，Tm的范围越小。DNA的(G+C)含量 Tm值的高低取决于DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高，Tm值越高。介质离子强度 离子强度低，DNA的Tm值也低。反之，则高。,Tm与DNA中(G+C)含量的关系,1.3.3.2 核酸的复性（renaurati
29、on）概念变性DNA在适当的条件下(除去变性因素)，可使两条分开的链按照碱基配对规律重新缔合(reassociation)成双螺旋结构，这一过程称为复性。复性后的DNA其理化性质和生物功能都得到部分恢复。复性的DNA溶液紫外吸收下降称为减色效应。,影响复性的因素温度和时间一般认为比Tm低25左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4以下)，复性几乎是及不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。降温时间太短以及温差大均不利于复性。,DNA浓度浓度越大，复性越快。DNA顺序的复杂性简单顺序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(T)这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。顺序复杂的DNA，如小牛DNA的非重复部分，一般以单拷贝存在于基因组中，这种复杂特定序列要实现互补，显然要比简单序列困难得多。,1.3.3.3 核酸分子杂交分子杂交(简称杂交，hybridization)是应用核酸分子的变性和复性的性质，使两条来源不同的具有一定同源性（即具有碱基互补关系）的DNA单链分子或DNA单链分子与RNA分子经退火形成双链DNA分子或DNA-RNA异质双链分子(heteroduplex)的过程。杂交是通过加热或碱处理使双螺旋解开成为单链，然后在一定条件下使互补核酸链实现复性。,
