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1、2009届现代生物科技专题专题复习,1:基因工程,第一章,2:克隆技术,第二章,3:胚胎工程,第三章,4:生物技术的安全性和伦理问题,第四章,5:生态工程,第五章,（1）基因工程的诞生,P1：基因工程的核心？,构建重组DNA分子（基因表达载体的构建）,基因工程诞生的基础,DNA是遗传物质的发现,DNA双螺旋结构的确立,中心法则,（1）基因工程的诞生,P1：基因工程的核心？,构建重组DNA分子（基因表达载体的构建）,限制性核酸内切酶（限制酶）DNA连接酶载体（运载体）,三大工具,工具酶仅指限制酶和DNA连接酶，不包含载体。,工具与工具酶的区别,基因工程的技术保障,限制性核酸内切酶（限制酶）,1、
2、作用特点：特定的序列特定的位点对外不对内2、作用的本质：在特定位点水解磷酸二酯键，把DNA分子切成片段3、效果：形成黏性末端或平末端,限制酶所识别的序列有什么特点？,GAATTCCTTAAG,反向对称重复排列(回文结构),EcolI,什么叫黏性末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,特点：单链凸出,G/CTTAA,AATTC/G,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,特点：没有单链凸出,CCC GGGGGG
3、CCC,CCCGGG,GGGCCC,Sma,分析限制酶的切割作用的一般方法,先将告知的单链变双链，明确识别序列及其碱基对数，然后根据切点画出黏性末端，对不同限制酶的末端进行比较作出答案。,下面是5种限制酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图（箭头表示剪切点、切出的断面为黏性末端）。限制酶1：GATC 限制酶2：CATG限制酶3：GGATCC 限制酶4：CCGCGG限制酶5：CCAGG下例叙述正确的是（）A限制酶2和4识别的序列都包含4个碱基对B限制酶3和5识别的序列都包含5个碱基对C限制酶1和2切出的黏性末端相同D限制酶1和3切出的黏性末端相同,为了解基因结构，通常选取一特定长度的线性DNA分子
4、，先用一种限制酶切割，通过电泳技术将单酶水解片段分离，计算相对大小；然后再用另一种酶对单酶水解片段进行降解，分析片段大小。下表是某小组进行的相关实验：,(1)由实验可知，在这段已知序列上，A酶与B酶的识别序列分别为_个和_个。,(2)根据表中数据，请在下图中标出相应限制性酶的酶切位点并注明相关片段的大小。,(3)已知BamH I与Bgl的识别序列及切割位点如图所示，用这两种酶和DNA连接酶对一段含有数个BamH I和BglU识别序列的DNA分子进行：反复的切割、连接操作，若干循环后,和 _ 序列明显增多。,ATCTAG,GATCT A,GCCTAG,GATCC G,DNA连接酶在脱氧核糖与磷酸
5、基之间形成磷酸二酯键,DNA连接酶,DNA连接酶分为两类：从大肠杆菌中分离得到：EcolDNA连接酶，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接。从T4噬菌体中分离到：T4连接酶，既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,将与模板链碱基互补配对的脱氧核苷酸连接起来形成子链,将两个DNA分子连接起来形成重组DNA分子,载体,能将外源基因送入受体细胞的工具就是载体。,种类：质粒、噬菌体和动、植物病毒,转基因技术的核心是构建重组DNA分子重组DNA分子基因表达载体，一个基因表达载体必须具有目的基
6、因外，还应该有启动子、终止子和标记基因等。,为什么不能将目的基因直接导入受体细胞完成转化呢？,载体,种类：质粒、噬菌体和动植物病毒,能够在宿主细胞中复制并稳定地保存对受体细胞无害具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有某些标记基因，便于进行筛选。,作为载体的必要条件,受体细胞,最常用的载体质粒,质粒细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子；质粒应具备以下几个条件：在宿主细胞内能自主复制，具有复制原点，可以使插入的目的基因在受体细胞内复制；有多个限制酶酶切点，且切点不在复制原点内；具备易于检测的标记基因，如抗生素抗性基因。但天然质粒往往不能满足上述要求，因此需要根据不同目
7、的和需要，对质粒进行人工改造，现在所使用的质粒几乎都是经过改造的。,（2）基因工程的的原理及技术,原理,变异类型：广义上的基因重组实现性状定向改造：目的基因在宿主细胞中稳定和高效地表达。即复制、转录和翻译,操作步骤,获得目的基因,形成重组DNA分子,将重组DNA分子导入受体细胞,筛选含有目的基因的受体细胞,目的基因表达,（2）基因工程的的原理及技术,获得目的基因,（2）基因工程的的原理及技术,方法1：从基因文库中筛选目的基因（需应用限制酶）,方法2：人工合成目的基因,反转录法,化学合成法,多数目的基因的获得方法真核细胞基因到原核细胞中表达,扩增目的基因,PCR技术,获得目的基因,形成重组DNA
8、分子,（2）基因工程的的原理及技术,具有相同的物质和结构基础以脱氧核苷酸为单位的双螺旋结构,重组的基础：,相同的限制酶与双酶切,形成的重组DNA分子上：既有目的基因又有标记基因,同一种限制酶相同限制酶（P6）,仅用限制酶EcoRI（GAATTC）切割：,限制酶EcoRI（GAATTC）和BamHI（GGATCC）联合切割：,某一DNA分子片段可被限制性内切酶Bbu I切成三段（切点为CGTACG），中间一段被限制性内切酶Not I切成两段（切点为GCCGGC）。,（1）在下面写出被两种限制性内切酶所切的一段DNA分子的两个黏性末端。该DNA片段能否首尾连接形成环？，为什么？。（2）上述的两种限
9、制性内切酶作用的化学键是否相同？为什么？（3）如上述的DNA片段中含有某目的基因，现要实现目的基因与运载体的结合，需要哪些酶？,CGTACG GCCGGC CGTACGGCATGC CGGCCG GCATGC,CATG-C/G,两个黏性末端的碱基不能互补配对,限制性内切酶作用于两个核苷酸间的磷酸二酯键,不能,相同,限制性内切酶Bbu I,DNA连接酶,G GCCGG CATGC C,+Not I,C/G-CCGG,获得目的基因,形成重组DNA分子,将重组DNA分子导入受体细胞,（2）基因工程的的原理及技术,常用的受体细胞：,大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,常用方法？,显
10、微注射技术,Ca2+处理诱导法,农杆菌介导法,增加细菌细胞壁还是细胞膜的通透性？,先导入土壤农杆菌的目的？,获得目的基因,形成重组DNA分子,将重组DNA分子导入受体细胞,（2）基因工程的的原理及技术,常用的受体细胞：,大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,常用方法？,显微注射技术,Ca2+处理诱导法,农杆菌介导法,在导入重组DNA分子时，不是所有的细胞都接纳了重组DNA分子！,获得目的基因,形成重组DNA分子,将重组DNA分子导入受体细胞,筛选含有目的基因的受体细胞,（2）基因工程的的原理及技术,分子水平：DNA分子杂交法（技术）,核心DNA探针,目的基因的脱氧核苷酸（单链
11、）序列片段,用荧光分子或放射性同位素标记,看能否形成杂合的双链区,获得目的基因,形成重组DNA分子,将重组DNA分子导入受体细胞,筛选含有目的基因的受体细胞,（2）基因工程的的原理及技术,分子水平：DNA分子杂交技术,标记基因筛选法,利用抗性基因,选择性培养基,Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因,图a示基因工程中经常选用的载体pBR322质粒，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。目的基因如果插入四环素抗性基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性。,a,b,Ampr,Tetr,c,再将灭菌绒布按到图b的培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布平移
12、按到含四环素的培养基上培养，得到如图c的结果（空圈表示与b对照无菌落的位置）。,为了检查载体是否导入原本没有Ampr 和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上，得到如图b的结果（黑点表示菌落）。,获得目的基因,形成重组DNA分子,将重组DNA分子导入受体细胞,筛选含有目的基因的受体细胞,目的基因表达,（2）基因工程的的原理及技术,：利用核酸（DNA-RNA）分子杂交法看是否生成了相应mRNA：用抗原抗体发生特异性结合看是否合成了相应的蛋白质：从个体水平看是否表现出特定的性状，如用棉花叶喂虫，看虫食用后是否死亡判断抗虫基因在棉花植株上的表达。,插入哪一条染色体、插入某一染色体
13、的位置都是随机的，这样可能破坏正常基因的结构和功能，使受体细胞不能完成某项生命活动甚至死亡。,目的基因插入动植物细胞基因组的随机性问题,糖蛋白是蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网上加工完成的。内质网存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这种细胞器，因此，由大肠杆菌中生产糖蛋白是不可能的。,基因工程中生产糖蛋白，为什么不选大肠杆菌而选酵母菌为受体细胞？,这就可以解释基因工程中为何用大肠杆菌生产人胰岛素原、而用酵母菌生产干扰素。,（3）基因工程的应用,一、基因工程与作物育种,1.抗虫转基因植物,2.抗病转基因植物,3.其他抗逆转基因植物（如抗盐、抗旱、抗除草剂植物等）,4.利用转基因改良植
14、物的品质,基因工程在农业上的应用：1）高产、稳产和具优良品质的品种2）抗逆性品种,基因工程在畜牧养殖业上的应用:,（3）基因工程的应用,一、基因工程与作物育种,二、基因工程与疾病治疗,（）基因工程药物,（2）基因诊断,（3）基因治疗,三、基因工程与环境保护,基因诊断,第二章,2:克隆技术,基因克隆（分子水平）细胞克隆（细胞水平）个体克隆（植物克隆和动物克隆）,一、克隆概念的发展（三个水平）,2:克隆技术,二、克隆技术的发展,1、微生物克隆（细胞克隆）2、遗传工程克隆（DNA克隆）3、个体水平克隆,2:克隆技术,三、动物克隆的条件,1、理论条件2、基本条件,具有包含物种完整基因组的细胞核的活性细
15、胞；能有效调控细胞核发育的细胞质物质；完成胚胎发育的必要的环境条件。,细胞(主要是包含遗传物质的细胞核)具有的发育全能性。,2:植物组织培养,理论基础,植物组织培养,核心概念,2:植物组织培养理论基础,植物细胞的全能性,细胞具有发育成完整植株的潜能。,这种潜能植物细胞的全能性。,植物体的每个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因。,不同种类、不同个体的植物细胞全能性相同吗？,2:植物组织培养的过程,离体的植物器官或组织或细胞（外植体）,愈伤组织,细胞分裂和脱分化,胚状体或不定芽,植物幼体,继续发育,（单细胞）,分散,一棵完整的植株,细胞分裂和再分化,需要适
16、宜的环境条件,2:植物组织培养的过程,离体的植物器官或组织或细胞（外植体）,愈伤组织,细胞分裂和脱分化,胚状体或不定芽,植物幼体,继续发育,（单细胞）,分散,一棵完整的植株,细胞分裂和再分化,光照问题:形成愈伤组织不需要光照而愈伤组织的再分化需要光照,愈伤组织细胞中有叶绿体吗？,适当调整植物激素的比例生长素与细胞分裂素的浓度及其比例不同调控脱分化和根与芽的再分化,2:植物组织培养中的核心概念,是将离体的植物器官(根、茎、叶、花、果实、种子等)、组织(形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚(成熟和未成熟的胚)、胚乳、原生质体，在无菌条件下培养在人工配制的培养基上，给予适
17、宜的培养条件，诱发产生愈伤组织、胚状体或不定芽等，再长成完整的植株，统称为植物组织培养。根据外植体来源和培养对象的不同，又分为器官培养、组织培养、胚培养、原生质体培养等。,植物组织培养:,2:植物组织培养中的核心概念,愈伤组织：,胡萝卜的愈伤组织,细胞排列疏松而无规则，是相对未分化的薄壁细胞群。,脱分化：,由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。,实质是指已经分化的细胞失去其特有的结构和功能变成具有未分化细胞（胚性细胞）特征的过程。,2:植物组织培养中的核心概念,无毒植物抗毒植物,再分化:,脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程
18、称为植物细胞的再分化。,实质是指已去分化的胚性细胞在某种诱导因素的激活下，再出现程序化的分化。,用于植物性药物生产,植物组织培养技术在科学研究和生产实践上具有多方面的用途,用于器官分化、形态建成、物质代谢以及细胞遗传、病毒学等方面的研究。,用于快速繁殖,用于培养无病毒植株,用于改良植物品种,2:动物克隆,高度分化了的体细胞的细胞核具有全能性；细胞质对细胞核的发育具有调控作用。,对生物遗传病的治疗对优良品种的培育和扩群对濒危动物的种质保护对转基因动物的扩群,直接意义：,体细胞克隆的深远意义：,动物克隆成功的意义？,动物的克隆繁殖,体细胞克隆,胚胎细胞克隆,指用胚胎细胞核移植的方法，包括胚胎细胞和
19、胚胎干细胞的核移植，以克隆出新的个体，是动物克隆技术的主要方法之一。,动物核移植是将动物的一个体细胞的细胞核（供体核）,移如入一个已经去掉细胞核的次级卵母细胞中，形成一个重建的“合子”，并发育成一个重组胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体。,肠上皮细胞,囊胚,实验证明：胚胎细胞核移植的成功率远高于成体细胞。,12,50,2:动物克隆的技术基础,细胞核移植,动物细胞培养,2:动物克隆的技术基础,动物细胞培养,动物体内一部分组织,分散的单个细胞,机械消化 或 胰酶消化,原代培养,传代培养,分散成单个细胞后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水
20、平操作的其他技术得以实现。用酶消化的是细胞间基质，细胞间基质主要成分有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用胰蛋白酶可使其消化，从而使细胞相互分离。,为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用酶消化的是什么物质？,动物细胞培养,动物体内一部分组织,分散的单个细胞,机械消化 或 胰酶消化,原代培养,传代培养,原代培养到一定时期，细胞会因为密度过大和代谢消耗引起营养枯竭，有害代谢产物积累，导致细胞不能正常生长，贴壁生长还会出现接触抑制现象，所以需要进行传代培养。,?,原代培养和传代培养,动物体内一部分组织,分散的单个细胞,机械消化 或 胰酶消化,原代培养,传代培养,分瓶前的培养是原代培养
21、，分瓶后的培养为传代培养。,细胞系和细胞株,细胞系：原代培养物开始第一次传代培养后的细胞称之为细胞系。其中，能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的细胞称为有限细胞系。大多数二倍体细胞为有限细胞系。无限细胞本质上已是发生转化（遗传物质改变）的细胞系，如肿瘤细胞。细胞株：用单细胞分离法或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。,动物细胞培养,动物体内一部分组织,分散的单个细胞,机械消化 或 胰酶消化,原代培养,传代培养,动物血清,使用CO2培养箱,把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术叫做克隆培养法（细胞克隆）。,克隆培养法（细胞克
22、隆）,第三章,95%空气5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。,3:胚胎工程,胚胎工程是将雌性动物的早期胚胎,或者通过其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之发育为新个体的技术。胚胎工程中需要用到的技术手段有体外受精、胚胎体外培养(动物细胞培养)、胚胎移植等。,1胚胎工程和相应的技术手段,3:胚胎工程,刚排出的卵子尚未完全成熟，仅完成第一次减数分裂，需要在输卵管内进一步成熟，直到减数第二次分裂的中期才能与精子结合完成减数分裂。所以在胚胎工程的体外受精中有卵细胞的采集和培养环节。,2刚排出的卵是成熟的卵子吗？,3:胚胎工程,体内受
23、精过程中精子是在雌性动物的生殖道发生相应的生理变化后，才获得受精能力。胚胎工程的体外受精中精子获能的方法有培养法和化学诱导法，牛、羊的精子常用化学药物诱导获能，诱导获能的药物常用肝素和钙离子载体。,3精子获能问题,3:胚胎工程,受精卵卵裂球(桑椹胚)囊胚原肠胚三胚层分化为各种组织和器官从卵膜孵出的幼体或从母体产出的幼体。,4胚胎发育的过程？,3:胚胎工程,(2009年浙江省会考试题)下列有关动物胚胎移植的叙述，错误的是 A受精卵或胚胎均能移植 B超数排卵技术要使用相关的激素 C 受体母畜必须处于与供体母畜同期发情的状态 D试管动物培养只是受精及早期卵裂过程在试管中进行,5受精卵可直接动物胚胎移
24、植吗？,5受精卵可直接动物胚胎移植吗？,解析：受精卵不断分裂，初期形成实心细胞团，形如桑椹，叫做桑椹胚。接着卵裂下去，桑椹胚中出现一个腔，形成一个囊泡状的结构，称为胚泡。胚泡的周围是一单层细胞，称为滋养层。进入子宫的胚泡，通过滋养层可分泌蛋白消化酶，与子宫内膜接触处的滋养层细胞迅速分化出另一层细胞，它们的细胞膜消失，形成一团含多个细胞核的细胞质合胞体滋养层。合胞体滋养层侵入子宫内膜，消化它所接触的子宫细胞，使子宫内膜溶解成一缺口，胚泡由此逐渐埋入子宫内膜。子宫上皮细胞增生将缺口修复，完成着床（植入）。由于受精卵表面没有滋养层结构，直接移植到子宫无法完成着床，所以在胚胎移植时用早期胚胎而不是受精
25、卵。陈阅增普通生物学第2版192页,3:胚胎工程,供体母本要选择 的个体；受体母本要选择 的个体；受体母本与供体母本需要同一物种是为了使移植的胚胎在受体子宫中。处理供体母本是为了，采集卵细胞,获得较多的胚胎；对供体和受体母畜进行注射 的同期发情处理，是为了使受体和供体的，这样才能使供体的胚胎移入受体后有相同或相似的生存条件，能够。,6供体母本、受体母本的选择和处理问题,具有优良遗传性状,健康和正常繁殖能力,不发生免疫排斥,超数排卵,促性腺激素,生理状态相同,正常发育,3:胚胎工程,促性腺激素可以促进雌性激素的分泌和卵细胞的生成。如果大量注射雌性激素，就会通过负反馈调节影响到下丘脑、垂体和卵巢的
26、分泌功能，减少，抑制卵巢活动，严重的话会导致卵巢萎缩，对机体健康造成了严重的危害。,7为什么对供体母牛和受体母牛注射促性腺激素而不是雌性激素？,促性腺激素,3:胚胎工程,内细胞团是囊胚阶段才出现，它是发育为胚胎本身的基础细胞，其他细胞为滋养细胞，只为胚胎和胎儿发育提供营养。若分割时不能将内细胞团均等分割，会出现含内细胞团多的部分正常发育的能力强，少的部分发育受阻或发育不良，甚至不能发育等问题（会影响胚胎的恢复和进一步发育）。但分割的份数越多，技术的难度会越大，移植后的恢复和发育的难度会越大，移植成功率自然会降低。,8对囊胚阶段的胚胎进行分割时，为什么要将内细胞团均等分割？,第四章,2下列有关胚
27、胎工程的叙述，正确的是A胚胎干细胞培养时，为了抑制其分化，常需接种在胚胎成纤维细胞上 B从附睾取出的成熟精子可直接与成熟的卵细胞受精 C胚胎分割的对象应选择受精卵 D胚胎移植最适宜的时期是原肠胚时期,第四章,采用显微手术（机械方法）的方法将早期胚胎分割成2分胚,4分胚或8分胚,经体内或体外培养后植入受体，以得到同卵双胎或同卵多胎的技术。胚胎分割的时期为：囊胚或桑椹胚。,51页：用于饲养层的细胞一般是胚胎成纤维细胞,4:生物技术的安全性和伦理问题,a.外源基因插入宿主基因组的部分往往是随机的，可能破坏正常基因的结构。如：(2008江苏卷)如果将外源基因导入小鼠受精卵，则外源基因可能随机插入到小鼠
28、受精卵DNA中。这种受精卵有的可发育成转基因小鼠，有的却死亡。请分析因外源基因插入导致受精卵死亡的最可能原因是。b.基因间存在相互作用的关系，外源基因引入后，是否会影响其他重要的调节基因，甚至会激活原癌基因？c.转基因生物可能威胁生态系统中其他生物的生存，使生态系统的稳定性发生改变。d.转基因技术广泛应用是可能产生“超级生物”，导致难以消灭的新病原体出现、产生生物入侵等造成生态学灾难。e.人类摄食大量转基因食品可能对有些人产生转基因食品过敏。,1对转基因生物安全性的担忧,4:生物技术的安全性和伦理问题,（1）反对进行克隆人的理由：克隆人严重违反了人类伦理道德；克隆人冲击了现有的婚姻家庭和两性关
29、系等传统的伦理道德观念；克隆人是制造在心理上和社会地位上都不健全的人；克隆技术尚不成熟。（2）赞成进行克隆人的理由：技术问题可以通过胚胎分割,基因诊断和染色体检查等方法得到解决；克隆人是一项科学研究，既然是科学，就应该允许研究克隆人。（3）中国政府的态度：禁止生殖性克隆人，支持治疗性克隆。,2克隆技术引发的伦理问题,5:生态工程,1物质的良性循环,使流向分解者的能量，有一部分可以食物中化学能的形式被人类再度利用，充分利用了废弃物中的能量，实现了能量的多级利用。,5:生态工程,通过建沼气池、巧接食物链、引入害虫天敌等措施，实现了物质的循环再生，能量的多级利用，让一些营养级利用前一营养级的废物或排泄物，实现废物资源化，大大减轻了环境污染。,2农业生态工程的意义？,5:生态工程,物质循环再生原理（如无废弃物农业）物种多样性原理（提高生态系统的抵抗力稳定性）协调与平衡原理（处理生物与环境的协调与平衡，考虑环境容纳量）整体性原理（考虑自然系统、经济系统和社会系统的统一）系统性和工程学原理系统的结构决定功能原理：考虑系统内部不同组分之间的结构，通过改变和优化结构，达到改善系统功能的目的系统整体性原理：实现总体功能大于各部分之和的效果,3生态工程的原理？,
