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1、9.2-生物技术与疾病诊断,常见传染病,甲类传染病：鼠疫、霍乱 乙类传染病：病毒性肝炎、细菌性和阿米巴性痢疾、伤寒、爱滋、淋病、梅毒、脊髓灰质炎、白喉、百日咳、流行性脑脊髓膜炎、猩红热、肾综合征出血热、钩端螺旋体、布鲁杆菌病、炭疽、流行性和地方性斑疹伤寒、流行性乙型脑炎、黑热病、疟疾、登革热、肺结核、新生儿破伤风。丙类传染病：血吸虫病、绦虫病、包虫病、麻风病、流行性感冒、流行性腮腺炎、风疹、急性出血性结膜炎，除霍乱、痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻。,海地霍乱,鼠疫（黑死病）,传统的传染病诊断技术:一是根据临床症状判断，但这必须要求被感染者发病，根据病状进行判断，况且有些疾病临床表现非常相似
2、，不具有典型性状，容易造成误诊！,二是先对病原物质进行分离培养，对培养物进行生理生化检验，从而确定病原体的种类。这种方法需要花费较多时间，成本高速度慢效率低，另外，有些病毒类和衣原体类的病原体至今仍没有有效的体外培养方法，从而影响了诊断.,现代生物技术的开发应用，为医疗卫生领域提供了崭新的诊断和监测技术。人们对 疾病，特别是传染病的诊断，一个很重要的问题就是如何尽早检测感染因子的种类，因为它对疾病的针对性治疗及其预后有着极其重要的意义。,DNA探针技术,一.ELISA技术与单克隆抗体,1.ELISA技术 ELISA技术称为酶联免疫吸附检测(enzyme linked immunosorbent
3、 assay)技术。其原理是将酶与抗体(原)交联形成酶-抗体(原)复合物。利用抗原与抗体的特异结合以及酶将无色底物催化成有色底物，并根据在一定范围内酶量与颜色呈正相关的关系进行检测。根据底物颜色的有无以及颜色的深浅可以判断阴性或阳性反应以及反应强度，可以用于定性或定量分析。,2.常用的ELISA诊断技术,测定抗体间的间接ELISA 病原体或其他外源大分子物质进入机体后都可能刺激机体产生相应的抗体，所以可以通过检测某种病原体的相应抗体来判断是否曾经某种病原体所感染，达到诊断的目的。测定抗原的双抗体夹心ELISA 病原体及其大分子物质进入机体后都可能成为一种抗原。所以检测机体内的抗原同样可以判断机
4、体是否感染了相应的抗原。,夹心法,3.基因工程抗原,传统抗原制备：1.体外培养病原体。再将病原体收集，经一系列处理后制成。2.对于不能进行体外培养的病原体，只能从受感染的动物或患者的组织中分离收集病原体，再经一系列处理后制成。,缺点：首先，抗原生产过程本身就有很大的危险。因为制造抗原时，要大量培养病原体，如果这些病原体逸出，将会造成很大危害；其次，产品的质量难以控制，难以标准化，从而导致各批次产品质量的差异；最后，生产费用高，特别是那些体外不能培养的病原体更是如此。,利用基因工程技术可以克服ELISA技术中需要制备抗体和抗原过程中的不足。同疫苗生产一样，将抗原基因克隆在细菌或真核细胞表达系统中
5、，由这些表达系统可以生产大量抗原。而且生产过程不必接触病原体，也便于标准化生产，成本低廉。,多克隆抗体与单克隆抗体,ELISA技术除了要制备抗原检测抗体外，有时还必须制备抗体，用于检测抗原。抗体的制备可以将制备的抗原直接免疫动物，在被免疫的动物的血清中将会含有相应的抗体，通过一系列的纯化技术就可获得相应的抗体。但由于一个抗原往往会有多个抗体的混合物，这种混合物称之为多克隆抗体。,利用多克隆抗体进行疾病的诊断，至少有几方面的缺点：特异性较低 产品质量难于控制 生产过程费时，步骤多且成本较高,单克隆抗体是利用细胞融合技术，在体外大量培养融合细胞，由融合细胞产生大量的抗体。由于单克隆抗体只识别某一特
6、定的抗原决定簇，所以它旅游特异性强、成分均一、灵敏度高、产量大和容易标准化生产等优点。因此，明显优于多克隆抗体。,单克隆抗体主要过程：1）免疫脾细胞的制备 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选 3）细胞融合 4）阳性克隆的筛选 5）克隆化 6）细胞的冻存与复苏 7）大规模单克隆抗体的制备,单克隆抗体虽然主要用于病原体感染的体外诊断，但其应用远不仅于此，其应用范围相当广泛，包括：1)鉴定微生物原体。2)确定激素水平。3)检测肿瘤相关蛋白质。4)检验血液中的药物 5)肿瘤检测 6)其他领域的应用。,二.DNA诊断技术,1978年，Kan和Dozy首先应用羊水细胞DNA限制性片段长度多态性（RFLP）做镰状细
7、胞贫血症的产前诊断，从而开创了DNA诊断的新技术。主要包括：DNA探针杂交技术PCR技术PCR-RFLP技术PCR-ASO技术PCR-ELISA技术PCR-SSCP技术PCR-DGGE技术LCR技术RFLP-探针技术生物芯片技术,DNA探针杂交技术,技术根据：来源不同的DNA加热变性后，只要两条多核苷酸链的碱基有一定数量能彼此互补，就可以经退火处理形成新的杂交体双螺旋结构。这种根据碱基互补配对原理而使两条不同来源的、有部分互补序列的两条单链相互结合形成异源双链的技术称为核酸杂交。核酸杂交不仅限于DNA和DNA之间，在RNA与DNA之间、RNA与RNA之间都可通过杂交形成双链.,基因探针：将已知
8、序列的特定基因用同位素、荧光素或酶进行标记，制备成一种诊断试剂。由于基因探针在适当条件下可与同源序列互补形成杂交体，因此，使基因探针与待检组织细胞内的基因片段发生杂交反应，通过探针上的标记观察探针是否与标本DNA结合，从而可判断标本DNA中是否有与探针一致的片段，最终对标本是否有遗传疾病或是否被某种微生物感染做出诊断。,PCR技术,聚合酶链反应（PCR）技术是一项体外扩增特异DNA 片段的技术。除了可以用于基因工程目的基因的制备外，还可用于某些疾病的诊断。寻找传染性因子的特异DNA序列，以这段DNA序列作为靶序列，设计特异引物，对待测样品进行PCR扩增。如果检测出了相应的扩增带件事则判定为阳性
9、反应。反之，无扩增带，则为阴性反应。,PCR-RFLP技术,限制性片段多态性（RFLP）是指由于碱基的改变导致DNA上的某一限制性内切核酸酶水解位点增加或减少。当这种DNA用限制酶水解时，产生的DNA片段数将相应的增加或减少，并且其DNA片段的分子质量也发生相应的改变。许多遗传疾病就是由于DNA上碱基的变化引起的。如果这种改变正好增加或减少了DNA限制性内切核酸酶的水解位点，那么就可以用PCR技术先扩增包括之一突变位置在内的DNA片段，获得大量的DNA片段后通过RFLP方法进行分析。,PCR-ASO技术,目前发现的遗传病中，许多疾病并不是基因的缺失或限制性内切核酸酶水解位点有关联的点突变。绝大
10、部分只是一些单纯的碱基突变，所以不能用上述的PCR技术或者PCR-RFLP技术进行诊断。但是每一种遗传性疾病都有一些经常发生突变的位点，称为突变的热点。利用这一特点可以进行PCR-ASO分析。ASO称为等位基因寡核苷酸。PCR-ASO的检测方法就是将待测的样品先经PCR扩增获得大量的待分析的DNA片段，然后将这些片段分别点样在固相支持膜上。另一方面，人工合成包括突变热点在内的1730个核苷酸的正常的和突变的寡核苷酸，并分别进行放射性同位素标记称为寡核苷酸探针。,利用这两种探针分别于膜上的PCR产物进行杂交。突变了的基因只能与突变的寡核苷酸杂交，而正常的基因只能与正常的个核苷酸探针杂交，通过放射
11、自显影技术便可判断杂交的结果，从而判断基因的突变与否。,样品,PCR扩增,待分析DNA片段,PCR,固相支持膜,正常寡核苷酸,突变寡核苷酸,同位素标记,同位素标记,放射自显影检测,PCR-ELISA技术,PCR-ELISA技术是指将PCR技术和ELISA技术结合起来的一种检验技术。在PCR的一对引物中，其中一条用生物素标记，另一条用地高辛标记，酶标微孔板上用生物素的亲和素标记（生物素的亲和素可以与生物素特异地结合）。PCR扩增后经过纯化去除引物dNTP和引物二聚体等小分子后，将PCR扩增后的纯化片段加入到微孔板中。此时微孔板上包被的生物素亲和素将与引物上的生物素结合而捕捉了PCR片段，再在微孔
12、板中加入碱性磷酸酯酶或辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，该抗体将于另一引物上的地高辛结合从而形成生物素亲和素-生物素-PCR片段-地高辛-抗地高辛抗体-酶的复合物。加入酶的相应底物后进行显色，便可判断PCR扩增的有无。,PCR-SSCP技术,该方法称为聚合酶链反应-DNA单链构型多态性。原理是利用了正常的和突变的DNA单链在三维空间构型上的差异，这种差异在电泳时将会有不同的电泳格局。其方法是将正常和突变的DNA样品经PCR扩增得到正常和突变的DNA片段。将这两种片段变性成为单链，两样品并行地进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。变性后的PCR产物的两条单链DNA将按其核苷酸序列的特征形成三维结构，并且突变样品的三维结构与正常样品的三维结构不同，从而形成不同的电泳格局。,PCR-DGGE技术,该方法称聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳技术,是将正常基因和突变基因分别进行PCR扩增，然后将扩增后的两种PCR产物混合后变性再复性。,LCR技术,LCR技术称为连接酶链反应。该方法的原理是设计两对引物1、2和1、2。其中1和1互补，2和2互补，1和2又与待测模板DNA的一条链互补，1 和2与另一条链互补。,THANKS!,
