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1、第三章 离体培养下的遗传与变异,Larkin和Scowcroft（1981）提出把由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系（somaclones），而把这些植株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异（somaclonal variation）。,从对生物遗传的影响而言，细胞工程技术本身即包含了双重性：遗传稳定性和变异性。对于单纯的繁殖技术而言，离体培养的技术操作是细胞或组织或个体的不断复制。然而因为起始培养的材料、培养基成分以及培养时间的不同，使其产生的无性后代的遗传稳定性也有了一定差异，这些变异是因为在培养过程中产生的，属于随机性变异。细胞工程还有一类技术操作，其目的就在于创造变异
2、，如体细胞人工突变、基因转移、体细胞融合等。这些离体操作技术，在某种程度上说具有一定的目的性和方向性，可以在短期内获得从自然界可能要经过几年乃至上百年的进化才能获得的性状，从而加速了生物进化的进程。,离体培养中的遗传与变异特点,体细胞变异的细胞遗传学基础,体细胞无性系变异诱导与选择应用,体细胞变异的分子遗传学基础,1 离体培养中的遗传稳定性,2 离体培养下变异,3 影响体细胞遗传与变异的因素,第一节 离体培养中的遗传与变异特点,一.离体培养中的遗传稳定性,离体培养的细胞学基础是有丝分裂，有丝分裂的DNA半保留复制和染色体的均等分裂机制，从理论上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性。在准确
3、选择培养方式的前提下，离体无性繁殖可以具有较高的遗传稳定性（Phillip等，1994）。正是基于这一理论，利用离体培养技术建立了多种植物的无性繁殖体系。,离体培养的遗传稳定性表现的另一个方面是即使发生某些变异，只需根据需要选择适当的培养方式进行离体繁殖，即可以淘汰或选择变异、或分离纯合体。离体培养下的变异均属于无性变异，即使变异发生，从个体的角度讲只会发生在少数性状上，因此，很容易从群体中剔除变异个体，从而可以维持离体培养群体的遗传稳定性。快速繁殖即是采用这一技术途径来保持所繁殖对象的品种典型性。变异也可以通过离体培养选择保留并快速纯化，这亦是离体培养遗传稳定性利用的途径之一。,二.离体培养
4、下变异特点,变异的普遍性,变异的局限性（特点）,嵌合性,部分植物离体培养再生植株的表型变异频率,就单个变异体来讲，离体培养中变异性状往往是单一的，或少数几个性状的变异。分析水稻种子愈伤组织起源的植株变异显示，在来自75个愈伤组织的1121个再生植株中，发生变异的植株，与供体品种比较只有1个性状表现差异的占72，2个以上性状表现差异的只占28。,然而就同一培养体系的再生群体而言，变异又具有多样性。黑云杉(shan)（P.mariana）65个系的7047个体细胞胚植株和白云杉（P.glauca）22个系的3995个体细胞植株的表型变异分析显示，尽管两个种的体细胞胚植株变异频率分别只有1.0%和1
5、.6%，但分析发生变异的植株变异范围确较大，按形态变异即可分为9类，仅在矮化型变异一个性状上也表现出一系列程度上的显著不同，生长45年后其植株高度呈现一系列变异类型，一些极度生长限制型矮化的株高只有几厘米，最矮类型的株高只有23cm，,与有性重组相比，体细胞突变性状具有一定局限性 从表型上看，在不同植物类型中经常发生的变异主要是植株形态（株高、叶形、叶色等）、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。从生理生化特性上看容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。,嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常见的现象。实际上，愈
6、伤组织在大多数情况下是一种具有不同染色体数和遗传变异程度不同的细胞组成的嵌合体，这些细胞各自进行不同步的分裂。,硬粒小麦(Triticum durum)6个无性系植株体细胞染色体数(括号外为个体数，括号内为染色体数),影响体细胞遗传与变异的因素,供体植物,培养基和培养方式,继代培养的次数,供体植物的遗传背景对体细胞变异具有直接影响。供体植株原有的倍性水平在培养细胞多倍化过程中起着重要作用，处于二倍体水平上的细胞比处于单倍体水平上的细胞较为稳定。植物种内基因型间变异频率差异较大。Tremblay等（1999）比较研究黑云杉和白云杉体细胞变异时也显示，黑云杉中体细胞变异频率最大的基因型可达57.6
7、，而有些基因型变异率则为0。白云杉种内不同基因型的体细胞变异，变异率最高的基因型可达42.6，而有些基因型则根本不发生变异。,谷子体细胞无性系R2的变异频率,以分生组织为外植体的再生植株通常可以维持供体植物的典型性，体细胞变异频率很低。在分化组织中，由于细胞分化过程中的核内有丝分裂或核内复制，其结果是在活体内组织分化期间就会出现体细胞多倍性。在植物体内，这些多倍性细胞在正常情况下不再发生分裂以维持正常分化细胞的功能，然而在离体培养条件下，培养基中的激素以及培养环境，就有可能刺激这些多倍性细胞分裂，进而分化形成多倍体植株。,普遍认为，培养方式、激素以及其它附加成分均会诱导体细胞变异的发生，因为离
8、体培养本身可能即是一种变异诱导的过程。培养基激素浓度和不同激素配比对再生植株的染色体倍性有一定影响。在豌豆根段培养物和细胞培养中发现，2，4D 0.25 mgL-1能增加多倍体细胞的有丝分裂，减少二倍体细胞的有丝分裂，而高浓度（20 mgL-1）则能促进二倍体细胞的分裂。在0.02 mgL-1激动素和1 mgL-1NAA的培养基上建立起来的纤细单冠菊幼苗愈伤组织，保存80天以后，其中多数细胞为二倍体，少数为四倍体。将这些愈伤组织转移到含不同激素水平的培养基上，发现其多倍体细胞的分裂频率不同。0.02 mgL-1激动素和4 mgL-1 NAA的多倍体分裂频率为20，而0.02 mgL-1激动素和
9、1 mgL-1 NAA时的多倍体分裂频率为100。出现这一现象的原因可能是因为多倍体细胞通常具有较强的环境忍耐能力，能够通过一些自体调节使细胞分裂。,激素除了引起染色体倍性的增加外，在一些培养中还发现染色体倍性减少的现象。首次报道培养过程中的染色体减数是在1948年（Huskins，1948），以后一些研究者在他们的工作中也相继发现这一现象，但有关体细胞倍性减数的资料还十分有限。顾蔚（1999）在蚕豆组织培养中发现，体细胞染色体减数与使用极端的激素浓度有关，在他的试验中不含激素的培养基其多倍体发生频率为6.31，在10 mgL-1NNA和2.5 mgL-1KT的培养基中，单倍体发生频率可达13
10、.03。,除了培养基的外源激素可以引起变异外，培养基的物理状态以及培养类型也会引起细胞的变异。一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养的细胞易产生变异。,原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养的变异，而细胞培养的变异又大于组织器官培养的变异。在细胞培养中，性细胞培养再生植株的变异要大于体细胞培养的植株。马铃薯原生质体培养再生植株的变异达到100，而茎尖培养再生植株基本没有变异。在因培养类型引起的变异中，不仅有染色体倍性的异常变异，同时基因突变、染色体结构变异、以及非DNA水平引起的变异亦相继增加。,由继代次数引起的体细胞变异几乎在各种类型的植物中均有报道。一般来讲，继代时间越长，继代次数越多，细胞变
11、异的机率就越高。烟草继代培养5年的愈伤组织，其再生植株与供体基因型相比，几乎没有形态正常的植株。染色体分析显示，这些植株大多为非整倍体和多倍体。玉米从刚诱导的愈伤组织中分化的植株，在形态上与供体基因型基本一致，但培养3年后愈伤组织的再生能力显著下降，再生植株生长异常，细胞学分析显示出染色体断裂和带型变异。,培养时间对掌叶半夏愈伤组织染色体变异的影响,第二节 体细胞变异的细胞遗传学基础,离体培养的体细胞变异，从本质上来说是细胞对环境压力的应答机制的调整。有学者认为，实现这一机制调整的始发点是放弃自然条件下的细胞学控制程序，重建新的细胞学控制程序，这种程序重建的结果导致了染色体数量和结构的改变（P
12、hillips等，1994）。,DNA 重复复制,染色体断裂与重组,非正常有丝分裂,一.DNA核内重复复制(endoreduplication）,DNA重复复制但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数增加，形成同源多倍体。如果这种DNA重复复制多次发生，细胞内DNA含量就会不断上升。Salon和Earle（1998）在硬粒小麦(Tripsacum dactyloides)的非成熟胚培养中观察到，存活的再生植株均为二倍体和四倍体，加倍后的植株在形态和发育方面均很正常。DNA的核内再复制在有些情况下可以反复进行。DAmato等（1980）报道，红花菜豆（Phaseolus coecineu，2n22）
13、幼胚离体培养形成的愈伤组织，正常二倍体细胞只占二分之一，由于DNA核内多次复制，有的细胞核内DNA值达到128c。一些中间类型的倍数性的形成，有研究认为可能是由于DNA经过重复复制后，在以后的复制中出现非同步复制或核融合所致。如第一次DNA复制没有发生分裂的4n核，在此后的分裂进程中，与正常分裂的2n核发生融合，从而形成六倍体（张冬生，1989）。,硬粒小麦中胚轴培养中DNA值的变化,近年研究显示，DNA核内重复复制的发生与细胞分裂周期的调控有关。在离体条件下，一些进入S期的细胞，在完成DNA复制后不进入下一阶段完成分裂，从而使细胞内DNA值和染色体倍性增加一倍。这种细胞进入间期后又开始DNA
14、合成，如果分裂能正常进行，则由此而产生的细胞即为四倍体。如果分裂仍然不能进行，则DNA值和染色体倍性就会再增加一倍，从而使细胞内DNA值和染色体倍性成2n形式增加。玉米胚乳和子叶发育研究显示，DNA重复复制可能与M期的不同CDK活性有关，而此时的CDK活性又受到磷酸化和去磷酸化的影响。同时，在玉米中还发现了CDK的抑制子CKI，DNA核内复制通过CDK的调控在动物发育和病理细胞中已被证实。因此，Larkins等认为，这一机制可能是DNA核内重复复制的重要调控途径。,拟南芥髓组织、成熟叶片以及托叶细胞多倍体发生过程的研究显示，一个在G2期表达的CDK基因CKS1At参与调节了DNA重复复制过程（
15、Jacqmard等，1999）。此外，Cebolla等（1999）在他们的研究中发现，一个与Cyclins降解有关的基因ccs52也与DNA重复复制和多倍体细胞产生有关。现有资料显示，DNA的核内重复复制可能涉及到一些与细胞周期调控基因的开启与关闭。,二.染色体断裂与重组,染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断裂与重组是离体培养中染色体结构变异的主要原因之一，也是体细胞变异中经常发生的现象，其细胞学特征是分裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及染色体桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位等多种类型的结构变异。,染色体桥,落后染色体,近年的研究认为，染色体断裂与DNA甲
16、基化程度有关。增加DNA甲基化，亦会引起染色体断裂。分析认为，甲基化程度的增加可能抑制DNA的复制效率，使得DNA复制不能同步，从而造成后期桥的产生和染色体的断裂。染色体结构变异既可发生在愈伤组织细胞中，也可发生在再生植株中，有时在一些再生植株的有性后代中也能观察到。产生染色体结构变异的再生植株一般生长不正常，生活力低下，很难长期生存，因此以保存种质资源为目的的离体培养应尽可能避免这种变异发生，以免造成基因资源流失。,三.非正常有丝分裂,离体培养中，染色体除了整倍性变异外，还可观察到大量的非整倍性变异，这种愈伤组织往往分化能力低下，再生植株大多生长不正常，有性繁殖遗传稳定差。,纺锤体形成异常使
17、得有丝分裂不正常是其原因之一。,核裂经常导致双核与多核细胞的出现。在红花菜豆的胚培养愈伤组织中，双核细胞有70有核裂现象，蚕豆子叶诱导的愈伤组织细胞的双核和多核细胞出现的频率也相当高。在核裂出现频率高的材料中，多倍体、亚多倍体和非整倍体细胞的出现频率亦相应提高。,第三节 体细胞变异的分子遗传学基础,体细胞变异除了发生在染色体水平上，更多的是在基因水平上的变异。从利用体细胞变异的角度看，染色体变异大多是一些畸形变异，真正可利用的染色体变异是十分有限的。基因水平上的变异在表型上大多只是个别性状的改变，不会影响再生植株的正常生长发育，因此，从再生植株的这些变异中就有可能筛选出有益的变异。基因水平上的
18、变异从根本上讲就是DNA水平上的碱基突变或修饰状态的改变。,碱基突变,DNA序列的选择性扩增与丢失,转座子活化,DNA甲基化,碱基突变是指DNA序列中碱基的改变。突变碱基的DNA序列处于结构基因的位置或调控序列的位置时，即可导致遗传状态的改变。碱基突变是产生体细胞变异的重要途径之一。,一.碱基突变,对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传而且符合孟德尔遗传分离规律，这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实。Brettell等从645株玉米杂种胚培养再生植株中，发现了一个稳定突变体Adh1（乙醇脱氢酶突变体），克隆基因序列分析发现，该基因第七外显子中一个编码谷氨酸的GAG中的
19、A转换成为了T，使翻译肽链中的谷氨酸转变为纈氨酸。植物的许多性状特别是经济性状均由多基因控制，对于多基因控制性状的碱基突变可能由于技术上的复杂性，目前还没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。,早在上世纪80年代Larkin和Scoworoft即提出，DNA序列的扩增与丢失也是体细胞无性系变异的原因之一。早期的研究认为，DNA值的改变与倍性变异是一致的。但近年来的研究显示，DNA值的变化是一个比较复杂的分子生物学现象。当DNA的c值以整倍性形式增加或减少时，其变化与染色体倍性的变异是一致的。然而，有些DNA值的变化却与倍性没有直接联系，这种变化大多是DNA序列的选择性扩增或部分序列丢失造成在原核
20、染色体中，DNA的量或真核细胞中单倍体DNA的量，称为C值；C值与生物结构与组成的复杂性不一致的现象，称为C值矛盾。离体培养下DNA序列的选择性扩增包括两种情况，一是重复序列的扩增，二是基因的选择性扩增。,二.DNA序列的选择性扩增与丢失,Lapitan等（1988）以生物素标记的480 bp重复序列DNA片段为探针，发现小黑麦杂种再生植株当代7R染色体短臂端粒位置上的这种重复序列发生了选择性扩增，而且这种扩增可以遗传至少三代。在水稻、小麦等作物中也发现一些微卫星DNA的扩增。水稻悬浮培养细胞的DNA分析发现，未分化的培养细胞中一些高度重复序列的扩增比供体材料高75倍，而不同品种的叶片这种扩增
21、差异只有23倍。亚麻卫星DNA和小麦rDNA研究中也有类似现象。,基因的选择性扩增在植物个体发育中经常看到。离体培养下的基因选择性扩增被认为是细胞在短期内为满足某种需要而产生足够的基因产物的一种调控手段。抗除草剂草甘磷的突变系就是一个典型的例子。草甘磷能抑制3-烯醇丙酮酸莽草酸盐-5-磷酸合成酶（EPSPs）活性，抗草甘磷突变体则具有较高EPSPs活性。DNA分析显示，这种突变体的EPSPs活性提高是因为参与编码该酶的基因选择性扩增，增加了mRNA水平，从而增加了酶的含量。Peter等的研究显示，在烟草抗草甘磷的突变体中，至少有2个与EPSPs合成相关的基因发生了选择性扩增，而且这些突变体在没
22、有草甘磷选择压力存在的情况下仍富含EPSPs mRNA。,在离体培养中，有时也会发生DNA序列丢失的现象。现有资料显示，DNA序列丢失多发生在rDNA及其它们的间隔序列，某些重复序列DNA区域也易发生丢失。Landsmann利用DNA随机克隆首先在马铃薯中发现了再生植株有DNA片段的丢失，随后Cullis和Clary采用类似的方法在亚麻再生植株中观察到rDNA的减少。以后在大麦、小麦以及水稻的培养再生植株中均检测到rDNA的减少。DNA的减少不仅发生在核DNA中，也有发生在叶绿体基因组中。一些DNA序列的减少只发生在愈伤组织形成阶段，再生植株过程中又恢复到正常状态，目前还不清楚这种变化的生物学
23、意义。,上个世纪80年代，Larkin和Scowcroft首先提出，转座因子的活化可能是体细胞无性系变异的原因之一。因为培养中细胞快速分裂，异染色质复制滞后，引起细胞分裂后期形成染色体桥和染色体断裂。在断裂部位的DNA修复过程中，位于异染色质区的转座子被活化继而转座，引起一系列的结构基因活化、沉默以及位置变化，造成无性系变异。我国学者朱至清认为，也可能是转座子在培养环境中首先被激活而转座，从而造成染色体的结构变异。,三.转座子活化,Peschke等以玉米Ac转座子测验系为母本，与1200个由未成熟胚再生的植株进行测交，根据种子糊粉层颜色色素的变化来确定再生植株中是否携带有活化的Ac转座子，结果
24、在56株中检测出Ac活化。苜宿组织培养再生植株中也观察到因转座子活化所引起的花色变异。,利用Ds转座子系统进行异源转化，在一些作物中成功观察到转座子插入的体细胞突变，从而证明转座因子确实诱导了体细胞变异。Mckenzie等为了建立一个稳定的转座子标签体系，将Ds/Ac转座系统导入球茎甘蓝中，获得的携带有转座系统的转化植株，在离体培养下增加选择压力，筛选稳定的转座子插入突变，结果观察到在获得到42个Ac切除的稳定Ds插入再生植株中，有29个植株发生了Ds再转座。足迹分析显示，在Ds Donor-site序列附近发生了大量的缺失和重组。,DNA甲基化在基因表达调控中具有重要作用。DNA甲基化和去甲
25、基化，不仅能通过调控基因的表达与关闭来控制生物的发育，同时也可以通过DNA甲基化途径来适应环境对生物体的压力。目前甲基化研究主要利用HpaII和MspI 两种甲基化敏感的限制性核酸内切酶进行比较分析。HpaII和MspI的酶切位点均为CCGG，当靠外的C被甲基化时，只能被HpaII酶切，当靠内的C被甲基化时，只能被MspI酶切，在一般情况下，与G相邻的C更容易被甲基化。利用两种酶切片段的差异即可分析DNA甲基化的变化。,四.DNA甲基化,离体培养再生植株的甲基化变化首先在玉米体细胞无性系再生植株中发现。来自玉米幼胚再生植株的某些无性系与供体相比发生了超甲基化，而另一些再生植株却只在与G相邻的C
26、上发生甲基化，而且这种甲基化在基因组中的分布不均匀。胡萝卜、番茄、马铃薯等多种植物的培养细胞或再生植株中，均报道发现了因DNA甲基化改变而产生的体细胞变异。,Kovaik等在烟草细胞悬浮系“TBY-2”培养中，观察到由于渗透压的改变，细胞DNA出现了超甲基化的现象。在培养基中加入NaCl或者甘露醇提高培养基渗透压，然后提取细胞DNA检测DNA甲基化变化情况。结果发现，在烟草基因组的2个异染色质区（HRS60和GRS），其CCG三核苷酸重复区和CCGG四核苷酸重复区的C几乎全部被甲基化。当把细胞转移培养到渗透压正常的培养基中时，DNA甲基化程度又可恢复正常。,除了DNA甲基化程度的增加外，离体培
27、养中的某些变异也为DNA甲基化程度的降低所致，最典型的例子是油棕体细胞胚植株的雄蕊雌性化变异。Rival等发现油棕体细胞胚植株中，大约有5的植株表现出雄蕊雌性化和完全不育。进一步研究发现，产生这种变异的愈伤组织有两种类型，一种是瘤状愈伤组织（NCC），另一种是快速生长愈伤组织（FGC）。来自NCC的变异植株，在种植9年后，所有植株均可恢复正常。而来自FGC的变异植株只有50能恢复正常。进一步分析显示，变异植株DNA甲基化程度分析显示，来自NCC的变异植株，C的甲基化率比正常植株减少了0.52.5。而来自FGC的变异植株，C的甲基化率比正常植株减少了4.5,第四节 体细胞无性系变异的诱导与选择,
28、体细胞无性系变异的筛选有以下一些明显的优点：可以在小空间内对大量个体进行选择。筛选可以在几个细胞周期内完成，且不受季节限制。因为试验在人工培养条件下进行，因此诱变和筛选条件可以根据需要进行调节和控制，从而提高了试验的重复性。由于变异是在单细胞水平上进行的，因此，一个突变体就是来自一个细胞，不会有非突变细胞的干扰，避免了整体植株水平上无性变异常呈现出的嵌合体。在细胞培养系统中，诱变剂可较均匀的接触细胞，因此可以引起培养细胞相对较高频率的发生突变，增加了选择机会。,体细胞无性系变异的表示方法主要有两种：一种是Chaleff提出的以R0、R1、R2、分别代表体细胞无性系变异的当代和自交以后的世代；另
29、一种是由Larkin和Scowcroft提出的以SC1、RC2、RC3、来分别代表体细胞无性系变异的当代和自交以后的世代。,诱变材料的选择,自发变异,细胞诱变,突变体筛选,体细胞变异的应用,选择起始材料需考虑以下几方面的问题:其一，目标性状的可行性。体细胞突变性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状是体细胞突变系选择的目的。其二，必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平。其三，适当的细胞类型亦是体细胞突变系筛选效率的重要条件。如原生质体、单细胞、小孢子等有较高的诱变频率。,一.诱变起始材料的选择,离体培养再生植株的自发变异比自然条件下的变异要高得多，一般可高出几
30、百甚至上千倍。体细胞无性系自发变异频率既与培养物的遗传背景、外植体类型及培养类型有关，同时也受培养时间、培养基成分等因素的影响。一般来讲，长期营养繁殖的植物、培养时间较长或继代次数多等，均容易出现较高的变异率。另外，培养类型中，原生质体、细胞、愈伤组织培养等所出现的变异频率要高于组织或器官培养的变异。离体培养中体细胞自发突变产生的变异比较稳定，没有人工诱变的后续干扰，有利于分离培养。,二.自发突变,三.诱变,常用的射线处理包括：X射线、射线、快中子、紫外线等。选择辐射类型应根据培养类型进行。以组织器官为诱导材料，可以选择辐射强度较大的射线、快中子等进行辐射。以细胞或原生质体，则可以选择X射线、
31、紫外线等。特别是以原生质体为诱导材料时，可以使用紫外线照射，因为常用紫外线的波长为270nm，与DNA吸收波长260nm相近，而原生质体因为没有细胞壁的屏障，对紫外线的敏感性较强，从而可以达到较好的诱变效果。,物理诱变,常用的化学诱变剂主要有：烷化剂（硫酸二乙酯 DES、乙基磺酸乙酯 EES、甲基黄酸乙酯 EMS、环氧乙烷 EO、乙烯亚胺 EI），此类诱变剂有一个或多个活化烷基，可与DNA分子中的碱基或磷酸基结合，改变DNA的结构而引起突变；碱基类似物（5溴尿嘧啶是胸腺嘧啶类似物、2氨基嘌呤是腺嘌呤类似物），在细胞内核酸复制时，这些类似物可以掺入到新合成的DNA分子中引起错配；移码诱变剂，如I
32、CR化合物和吖啶类似物等。此外亚硝酸、羟胺等某些抗菌素等亦可引起突变产生。,化学诱变,转座子插入诱变是近年来利用分子生物学技术发展起来的新的体细胞变异诱导方法。转座子既可直接将外源基因带入细胞内获得新性状，又可以独立插入通过其转座功能诱导变异。目前，使用较多的转座子体系主要是玉米的Ac/Ds系统，其主要操作过程是首先采用基因转化的方法将Ac/Ds导入受体细胞，再通过体细胞培养或再生植株的自交或测交使Ac因子切除，由于转座子插入的随机性，即可在切除Ac的植株中筛选出不同变异。利用这一途径已在苜宿、马铃薯、番茄、甘蓝等多种植物上获得可利用的体细胞变异植株。,转座子插入诱变,直接筛选,间接筛选,四.
33、突变体的选择,其方法是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体。贾敬芬等以小麦幼胚愈伤组织为材料，在含有1.4 NaCl的N6培养基上直接筛选出小麦耐盐系。分析显示，耐盐系游离氨基酸含量是供体亲本的4.1倍。郑企成等也曾将小麦“京花1号”花药经射线处理后，再经0.5 NaCl培养基直接筛选获得耐盐再生株系。李爱贤等以甘薯“栗子香”为材料诱导胚性细胞系，从900个通过射线辐射的细胞团
34、中，在含有2.0 NaCl的培养基中进行筛选，获得22个抗盐愈伤组织，并获得20个抗盐再生植株。,直接选择,Moon等将玉米愈伤组织培养在含有Al3+的培养基上，直接筛选出耐铝的突变体Cat-100-6。经过4代自交，突变系仍有较好的忍耐铝的能力，与供体近交后代的耐铝能力表现为中间类型。,间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。Dorffling等以Pro类似物羟脯氨酸（HYP）为选择剂，获得了耐HYP的体细胞变异系，其抗寒性比供体亲本增强，且能稳定遗传。林定波等将锦橙株心细胞愈伤组织的悬浮细胞经射线照射，然后在高浓度脯氨酸培养基中培养筛选，获得了抗寒体细胞变异愈伤
35、组织，并再生植株。鉴定显示，抗寒愈伤组织及其再生植株的抗寒性分别比供体提高1.4 和2.4，突变系体内的Pro含量比供体增加了一倍。,间接选择,五.体细胞变异应用,创造育种材料培育新品种,遗传学研究,代谢研究,发育生物学研究,据统计，诱导突变已被用来改良诸如小麦、水稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子繁殖的重要作物。在全世界50多个国家中已发放了1000多个由直接突变获得的或由这些突变体相互杂交而衍生的品种。这些品种的主要特性包括品质改良、增强抗病性、抗逆性等。,创造育种中间材料或直接培育新品种,在各国现有通过体细胞诱变选育的谷类作物品种中，品质得到不同程度改良的占34.3。意大利选育的硬粒小麦
36、Creso，品质好、产量高、适应性强，成为该国小麦种植主栽品种。通过射线处理选育的面包小麦Sharbati So06ra，蛋白质含量由原品种的13提高到16，赖氨酸含量从2.26提高到2.96。在水稻方面，国外至少育成了12个米质优良的品种，如日本的美雪锦、宾系酒18号、加贺光、富士光、宵锦，美国的Calmochi201等等。法国选育的Delta，以其良好的籽粒品质占该国水稻总面积的20。此外，还有丹麦无花青素原大麦Galant，其商业应用价值在于能保持啤酒的稳定性。,据不完全统计，诱变品种中大约有1/4是抗病品种，其中80左右为抗真菌品种。包括水稻抗稻瘟病、白叶枯病、稻胡麻叶斑病等的突变体，
37、小麦抗锈病、白粉病、根腐病和耐赤霉病的突变体，大麦抗白粉病、病毒病和纹枯病的突变体，玉米抗大小班病和青枯病的突变体；高粱抗丝黑穗病、谷子抗白发病的突变体；大豆抗灰斑病和病毒病的突变体；菜豆抗黄班病毒病的突变体；马铃薯抗黑斑病的突变体，白菜抗霜霉病的突变体；油菜抗花叶病的突变体等（孙光祖，1995）。耐盐、抗旱、抗寒变异也已筛选出众多中间材料，有的已进入区域试验，有的已用于生产。,突变体直接用于基因功能鉴定。突变一旦发生，即可在表型上与供体显著不同。突变DNA序列用作分子标记进行遗传研究。利用突变体策略已分离出一些功能基因和抗病基因，如玉米乙醇脱氢酶基因ADH，赤霉素合成相关基因GA1、GA4，
38、生长素敏感性基因AUX1、AUX2、番茄抗病基因Df9等。,遗传学研究,利用体细胞突变策略对植物发育的基因调控研究已在模式植物拟南芥和金鱼草等植物中广泛开展，并分离出一大批不同发育阶段和组织类型的突变体，包括顶端分生组织、根、开花转变、花序、花分生组织、胚胎发育等的系列突变体。通过这些突变体研究，不仅建立了器官发育模式，而且分离鉴定了一大批与发育有关的基因，包括维持正常发育状态的基因、促进发育进程的基因，以及相关修饰基因。,发育生物学研究,以突变体为工具，还从组织学和细胞学角度分析鉴定了一些基因的表达与植物发育的关系。在烟草、玉米中均通过质体突变体分离鉴定了与植物叶绿体发育有关的核基因。玉米黄
39、化突变体pun是一个在光照下不可逆转的突变体，分析显示，该突变体为一核单基因隐性突变，该基因的突变扰乱了叶绿体基因编码的蛋白质积累，进而使叶绿体膜系统发育不足，类囊体相关蛋白不能积累。,突变体作为代谢活动调控研究的工具，具有十分便利和高效的优势。体细胞突变技术的不断成熟，使多细胞生物大群体突变的建立成为可能。我们可以根据需要建立某一代谢途径中每一个调节点的突变体，也可以根据需要与基因工程相结合，对一些关键调控过程进行修饰和改造，使代谢过程按照人类需要进行。因此而发展起来的新型学科领域称之为代谢工程。,代谢途径研究,植物突变体用于代谢研究，早期最经典的例子是烟草突变体对硝酸还原酶的研究。硝酸还原酶缺失突变体有cnx和nia两种类型，分别通过影响钼因子和酶蛋白来影响硝酸还原酶的活性，两种突变体细胞融合子可以互补在只有硝酸盐的培养基中生长。近年来，通过体细胞突变研究激素、次生代谢产物等代谢途径的研究已有许多报道。如番茄推迟成熟的突变体Nr，与乙烯应答基因突变有关；玉米胚乳皱缩型突变（sh）可能涉及到蔗糖代谢的相关酶基因的突变，分析野生型和突变型的蔗糖合成酶和碱性转化酶活性显示，野生型的蔗糖合成酶活性比突变系高，而碱性转化酶活性比突变系低。,
