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1、第一章 菌种与种子扩大培养 重点：微生物工业对菌种的要求；生产用菌 种的保藏及选育；防止菌种衰退的措施 难点：工业微生物的培养类型,第一节 微生物工业用菌种一、微生物工业对菌种的要求 培养基原料来源广、廉价；培养条件易控制；对于微生物的生长往往存在一个“临界溶氧浓度”，低于这个溶氧浓度，氧就成了微生物生长的限制性因子。pH值:中性偏酸性，偏碱性，强烈的pH值易改变产物和底物的状态。温度：最低、最高、最适生长温度，低温菌，耐高温菌种。渗透压：等渗,发酵周期短；菌株高产；对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶。对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体
2、易破碎；对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体内，对于包含体，要求在细胞破碎时不易破碎，而在目的产物的分离提取时，则易破碎。抗病毒（噬菌体）能力强；菌株性状稳定，不易变异退化；菌体本身不能是病原菌；二、工业常用的微生物,从微生物分类学的角度，分为：,细菌类：短杆菌：氨基酸发酵（谷氨酸）枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白 酶等 地衣芽孢杆菌：耐高温-淀粉酶)苏云金芽孢杆菌：BT生物农药 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等发酵酵母菌：啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵 酒精酵母：酒精 汉逊酵母：食品工业，用于乙酸乙酯的发酵 假丝酵母：scp生产，石油发酵,霉菌：黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、
3、酶制剂工业（糖化酶）黄曲霉：酱油生产(3042)，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒（女儿红）的生产；使用红色色 素的生产；豆腐乳的生产等 赤霉菌：赤霉素的生产，是一种植物生 长激素,工业常用的微生物：细菌,工业常用的微生物：放线菌,工业常用的微生物：霉菌,三、生产菌种的保藏与选育 菌种保藏（1）目的：存活，不丢失，不污染；防止优良性状丢失；随时为生产、科研提供优良菌种。（2）基本原理：根据菌种的生理生化特点，人工地创造 条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态。（3）常用的菌种保藏方法：斜面低温保藏法、甘油低温保藏法、砂土保藏法、麸皮保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温冻结法
4、等。,几种常用菌种保藏方法的比较,划线培养后的细菌菌落,酿酒酵母,霉菌孢子,国内外菌种保藏机构：菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)美国的典型菌种保藏中心(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）工业微生物 http:/www.china-cicc.org/农业微生物 http:/,四、菌种选育（1）目的：改善菌种的特性，使提高产量，改进质量，降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用等。（2）方法：A、自然选育；B、抗噬菌体菌
5、株选育；C、诱变育种；D、代谢控制育种；E、基因重组育种；五、防止菌株衰退的措施 1、菌种退化：多次传代，发酵力、繁殖力下降；发酵产物得率低。2、衰退的可能原因 菌种保藏不妥；培养要求未得到满足；,3.防止菌种衰退的方法 尽可能满足其营养条件、培养条件，避免有害因素 影响；尽量减少传代次数；采用幼龄菌种；4.菌种复壮方法 分离复壮（稀释平板法、平板划线法等）；若单菌落分离不行，可改变培养条件，或两者结合进行复壮；诱变因素处理，再进行单菌落分离；,第二节 种子扩大培养一、种子扩大培养的任务 1.任务：每次发酵罐的投料，要提供相当数量代谢旺盛的种子。根据菌种生长速度快慢来决定扩大培养的级数；2、三
6、级发酵（50吨发酵罐）：斜面一级摇床二级种子罐三级种子罐发酵罐二、工业微生物的培养类型 静置培养法（厌气性发酵）；少，如酒精发酵 通气培养法（好气性发酵）；主要，如抗生素等通气培养法作为种子扩大培养的具体方法：液体培养法：三角瓶摇床震荡或回转式培养；表面法培养：液体表层，菌体生长于表面；,固态法培养：固体培养基表面生长大规模工业生产的培养方法及特点：固体培养（曲法培养）浅盘固体培养 深层固体培养 特点：酶活力高，但劳动强度大，曲层需翻动。液体培养 浅盘液体培养：已不用，占地面积大 液体深层培养：几乎所有的好气培养都采用 特点：培养条件易控制，如温度，pH等，但易染菌，要求无菌。,载体培养：吸收
7、了固态的曲法培养与液态培 养的优点，是近年新发展的一种培养方法。特点：固态基质做载体，发酵结束后将培养基及菌体挤压出来，载体可反复使用，如脲烷泡沫塑料块。两步法液体深层培养：在酶制剂和氨基酸生产中应用较多。特点：控制菌体生长条件与产酶条件区分开来，如先菌体生长，再改变条件产酶。,三、影响种子质量的主要因素 1.培养基 主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。对于种子用的培养基，摇瓶与种子罐用的培养基不相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微生物较易利用的碳源；对于种子罐用培养基，要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有
8、利于菌体的增殖。例如：HASS（高温淀粉酶）三角瓶用碳源：葡萄糖+乳糖 3m3种子罐：液化淀粉,2、种龄与接种量：,种龄以对数期为宜；接种量宜适当大；接种量大的优缺点：优点：缩短发酵周期；减少染菌机会；提高设备利用率 缺点：种子培养费时；增加级数；代谢废物多,3.培养条件 温度：温度直接影响生长和酶的合成；种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的温度，目的在于使菌种逐渐适应。许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：30，而产物合成温度为32-34 pH值：对微生物有明显的影响。1）扩培选择的p
9、H值是菌体的最适生长pH值。2）培养基灭菌后，通常其pH值要下降0.51.0个单位,通气搅拌：（溶解氧的作用：参与菌体呼吸 作用）菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖速度越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，从这个意义上讲，扩培过程中应提供足够的氧气。足够的溶氧取决于：搅拌转速、通气量、搅拌功率等 泡沫(危害：影响微生物对氧的吸收；妨碍CO2的排除；减少设备利用率)消泡方法：化学法（为主）、机械法常用消泡剂：植物油，矿物油等,3.染菌的控制 染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严、菌种不纯；4.种子罐级数：级数少则简单 种子罐级数的选择取决于：种子的性质（生长繁殖性能）；孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）；孢子发芽及菌丝繁殖速度；发酵罐中种子的最低接种量（一般10%）；种子罐与发酵罐的容积比；,思考题,1、能源问题是全球面临的问题，生物工程将如何解决？2、比较固体培养与液体培养的优缺点。3、菌种扩大培养的目的和意义是什么？4、工业生产用菌种的基本要求有什么？5、种子罐级数的选择取决于那些因素？6、简述加大接种量的优缺点。7、简述防止菌种衰退的方法。,
