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1、药物色谱分析-6化学键合相色谱法,一、化学键合相的特点和分类二、化学键合相填料新进展三、非极性键合相色谱法四、极性键合相色谱法五、离子交换键合相色谱法,主要内容,第一节 化学键合相的特点和分类定义一、特点：消除了担体表面活性作用点，清除了某些可能的催化活性耐溶剂冲洗，使用过程中固定相流失热稳定性好表面改性灵活，容易获得重复性产品载样量大，溶剂残留效应小，梯度洗脱平衡快,二、化学键相的稳定性键合相中Si-O-Si键易受Lewis酸、NaOH、KOH等亲电试剂的进攻而断裂，在低pH和高pH条件下均不稳定。高温会使硅胶溶解，键合硅胶在150下使用为宜物理吸附的水会与硅烷化试剂作用形成副产物,其在有机
2、溶剂中溶解,造成表观的键合相流失的现象.三、化学键合相的分类极性键合相、非极性键合相、离子交换键合相三种,第二节化学键合相填料新进展,发展方向：提高填料的化学稳定性、热稳定性，以及改善选择性、提高分离度和适用性一、空间保护键合固定相在C18烷基的侧链引入较大官能团，阻碍硅羟基与分析物的相互作用，如异丙基或异丁基取代,每个硅烷化试剂分子中含有两个硅原子，每个硅原子含有一个长链硅烷基官能团，如Agilent公司的ZorbaxExtend-C18色谱柱，在高流动相中稳定性极佳，适于分离游离的强碱性化合物,二、双齿键合固定相,解决利巴韦林等强水溶性药物在反相柱中分析的难题，内嵌极性官能团是改善固定相和
3、水溶液兼容能力的途径。1、1995年Waters公司推出专利极性官能团嵌入技术，如右图,三、内嵌极性基团键合固定相,图9-5内嵌极性官能团结构示意图,水屏蔽层能够掩蔽解离后带负电的硅羟基，减少拖尾，另可降低脱水现象，使填料和样品作用完全，在含水量高的流动相中，样品也有稳定保留和最佳峰形,三、内嵌极性基团键合固定相,2、Agilent公司的Zorbax Bonus-RP色谱柱:内嵌酰胺基和三封端技术，图9-83、内嵌磺胺基官能团键合相，有更出色的水解稳定性如图9-9（Dionex公司）,4、Phenomenex公司的Synergi Fusion-RP色谱柱E采用极性嵌合及书疏水链来达到高选择性的
4、效果,1999年Waters公司发明了杂交颗粒技术，制成了Xterra色谱柱填料具有分离效率高、峰形优良、范围宽、分析速度快，,四、硅碳杂化硅胶,五、优化柱床设计六、苯基丙胺键合固定相七、以氧化锆为基质的键合固定相八、包覆型填料,第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）,一、疏溶剂作用理论,影响溶质分子色谱保留的因素,溶质分子中的非极性部分总表面积对色谱保留值的影响。键合相表面烷基的总表面积对色谱保留值的影响 烷基的含碳量、键合相表面的含碳量对色谱行为有重要影响洗脱液的表面张力对色谱保留值的影响,第三节 非极性键合相色谱法（non
5、-polar bonded phase chromatography）,二、双保留机制,第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）,三、非极性键合相色谱法的流动相的组成基本要求:纯度高、沸点适中、黏度小、化学稳定性好、紫外吸收本底小、对样品有较宽的溶解范围、与所选的色谱系统相匹配混合溶剂的黏度一般高于纯溶剂的黏度，流动相组成变化时压力升高的现象在应用梯度洗脱时应特别注意,第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）,三、非极性键合相色谱法的流动相的基本组成1、一元溶剂系统：
6、一般不采用纯水系统2、二元溶剂系统：一般采用洗脱能力较弱的水作为底剂，再加入一定量与水相混溶的有机溶剂作为调节剂，如甲醇、乙腈，也可考虑四氢呋喃3、三元溶剂系统：在二元溶剂系统基础上添加四氢呋喃、三乙胺、离子对试剂、缓冲盐、醋酸、磷酸等,第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）,四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则,第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）,四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（一）中性化合物的分析,第三节 非极性键合相色谱法（non-pola
7、r bonded phase chromatography）,四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（一）中性化合物的分析1、改变有机溶剂的比例筛选步骤：,第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）,四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（一）中性化合物的分析2、改变有机溶剂的类型流动相的洗脱强度与有机溶剂的类型有关如图：,第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）,四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（一）中性化合物的分析2、改变有机溶剂的类型一般改变有机溶剂不
8、会影响样品的出峰顺序，但也有特例如图：,第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）,四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（一）中性化合物的分析3、使用混合有机溶剂：在二元系统不能分离时采用如图,第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）,四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（一）中性化合物的分析3、使用混合有机溶剂采用下图方法设计实验分离样品,例：取代萘的溶剂选择性实验，如图,第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromat
9、ography）,四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（二）酸性化合物和碱性化合物的分析：与中性化合物分析相似，区别是加入pH值调节剂和缓冲盐。pH值的选择：目的是调节流动相的pH值或利用同离子效应，抑制样品组分的解离，增加其在固定相中的溶解度，达到分离有机弱酸弱碱的目的，称为离子抑制色谱（ISC）适于分析的3.0pKa7.0弱酸，7.0pKb8.0弱碱或两性化合物,流动相对反相保留的影响与样品类型（酸、碱、中性）的关系，如图,表 酸性、碱性官能团的pKa值,第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）,四、非极性键合相色谱法的流
10、动相的设计原则（二）酸性化合物和碱性化合物的分析：缓冲盐的选择：目的是维持组分在色谱柱的内的平衡，得到较好的重现性。要求：应具有适当的缓冲容量缓冲溶液浓度应适当，一般为1050mmol/L与色谱系统相匹配，注意缓冲剂的截止波长缓冲液的挥发性，应尽量选择挥发性缓冲盐,第三节 非极性键合相色谱法（non-polar bonded phase chromatography）,四、非极性键合相色谱法的流动相的设计原则（二）酸性化合物和碱性化合物的分析：胺类添加剂：在分析碱性化合物时抑制拖尾现象,建立酸性和碱性样品分析方法的步骤图示,分析酸性和碱性药物时的常见问题及方法,分析酸性和碱性药物时的常见问题及方法,第四节 极性键合相色谱法（polar bonded phase chromatography）,极性键合色谱法的特性,第四节 极性键合相色谱法（polar bonded phase chromatography）,极性键合色谱相表面的基团组成：键型、主体基团和极性端基，如图,第五节 离子交换键合相色谱法（ion exchange chromatography,IEC）,以离子交换剂为固定相,以缓冲液为流动相,借助试样中电离组分对离子交换剂亲和力的不同而达到分离离子型或可离子化的化合物的目的的方法,谢谢各位！,
