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1、细菌性食物中毒样品的采集及实验室检测程序,北京市疾病预防控制中心陈 倩2013年4月,食物中毒样品种类和采集方法采样注意事项实验室应急检测程序,食源性疾病,WHO：由于食物中含有致病因子引起的以急性病理过程为主要临床特征的感染性或中毒性疾病 美国CDC：由于食用了受污染的食品或饮料而引起的疾病包括常见的食物中毒、肠道传染病、人畜共患传染病、寄生虫病及化学性有毒有害物质所引起的疾病。食源性疾患的发病率居各类疾病总发病率的前列，是当前世界上最突出的卫生问题。,食源性疾病特点,爆发和散发两种形式肠道传染病存在人与人之间传播种类多、潜伏期不同不一定出现明显消化道症状,细菌性食源性疾病,细菌性食源性疾病
2、：是进食被细菌或细菌毒素污染的食物而引起的感染性或中毒性疾病。细菌性肠道传染病（霍乱、痢疾、伤寒副伤寒、O157短期内集中发病常被诊断为细菌性食物中毒散发或潜伏期较长病例常被诊断为胃肠炎或其他疾病,食物中毒相关概念,食物中毒：摄入了含有生物性、化学性有毒有害物质的食品或者把有害物质当作食品摄入后出现的非传染性(不属于传染病)的急性、亚急性疾病。食物中毒诊断标准主要以流行病学调查资料及病人的潜伏期和中毒的特有表现为依据，实验室诊断是为了确定中毒的病因而进行的,食物中毒的致病因素,2012年全国报告食物中毒917起 微生物引起的患者数最多，占总数的50%美国食源性疾病爆发细菌性的占总起数的75%，
3、占病例数86%。我国细菌性食物中毒发生起数同样常年居首位,美国食源性病原体,空肠弯曲菌产气荚膜梭状芽孢杆菌出血性大肠杆菌O157单增李斯特菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌圆孢子虫隐孢子虫,常见细菌性食物中毒,沙门氏菌、志贺氏菌、致泻性大肠杆菌、副溶血性弧菌、其它致病性弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、出血性大肠杆菌O157、单增李斯特菌、耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、变形杆菌、耶毒假单胞菌酵米面亚种、气单胞菌、肠球菌等,细菌性食物中毒的特点,与饮食有密切关系，去除原因食品后，不再有新的患者。临床症状以急性胃肠炎为主，基本相同。短时期内多人发病，无人传染人的现象。中毒发生与不同区域人
4、群饮食习惯有密切关系。与季节相关。细菌繁殖条件及人体防御机能。发病率高，病死率较低、恢复快、多数预后良好,细菌性食源性疾病的流行病学,传染源：被病原菌感染的动物或人传播途径：通过进食被细菌或其毒素污染的食物人群易感性：普遍，无病后免疫力，可重复感染流行特征：夏秋季高发；病例可散发或爆发流行；发病急，时间集中，潜伏期短；有共同进餐史；症状轻重与进食量有关。,细菌性食源性疾病的发病机制,感染型细菌污染食物在条件适宜时大量繁殖，人食入大量活菌的食物，引起消化道感染而造成的中毒。细菌毒力、细菌污染程度、进食量多少、人体抵抗力等因素与症状轻重直接相关。较少引起败血症或严重毒血症，病程较短（沙门氏菌、副溶
5、血性弧菌）,感染型 活菌污染食品|适宜条件 食品中大量繁殖（菌量一般106）|人摄入 侵犯消化道粘膜 消化道 体死亡放出内毒素 引起充血、水肿、渗出等炎症 作用于体温调节中枢 发烧 消化道症状,细菌性食源性疾病的发病机制,毒素型细菌污染食物在其中繁殖并产生大量毒素，人食入大量毒素的食物而造成的中毒。临床症状与食入毒素量正相关起病急，不发热，病程短，可引起败血症或严重毒血症（葡萄球菌肠毒素、肉毒毒素）,毒素型活菌污染食品|适宜条件 食品中大量繁殖产生外毒素（如肠毒素、神经毒素等）|摄入含外毒素的食品而中毒|出现相应外毒素的特殊临床表现,食物中毒诊断标准和处理原则GB14938,产气荚膜梭菌食物中
6、毒诊断及技术处理原则病原性大肠艾希氏菌食物中毒诊断及技术处理原则变形杆菌食物中毒诊断及技术处理原则变质甘蔗食物中毒诊断及技术处理原则霉变谷物中呕吐毒素食物中毒诊断及技术处理原则耶毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒诊断及技术处理原则沙门氏菌食物中毒诊断及技术处理原则葡萄球菌食物中毒诊断及技术处理原则副溶血性弧菌食物中毒诊断及技术处理原则蜡样芽胞杆菌食物中毒诊断及技术处理原则肉毒梭菌食物中毒诊断及技术处理原则,现场调查流程,建立病例定义，制定采样计划（提出假设）验证假设可疑样本采集和送检实验室检验采取控制措施调查结论和书面报告,建立病例定义,72h内食用了共同餐次食品是否到医院就诊、是否服药24h腹泻3
7、次以上症状体征明显,建立病例定义,核实病例数确定事件的存在描述疾病的三间分布时间分布地区分布人群分布,现场调查主要物品清单,采集工具 长柄勺、剪刀、铲子、小刀、镊子、夹子、吸管、启瓶器、采便管、注射器、消毒棉签、采样棉球、消毒纱布、酒精灯、压舌板、皮筋、记号笔、标签纸等样品容器 无菌塑料袋、广口瓶（200-500mL)、运送培养基试管、生理盐水、灭菌平皿、一次性小试管、便盒、样品冷藏设施等,现场调查主要物品清单,防护用品 白色工作服或隔离衣、医用手套、口罩等调查用表 食物中毒个案调查表、卫生监督文书、采样单等 取证工具 照相机、摄像机、录音机 其他相关专业参考资料,食物中毒采样目的,查明病因和
8、来源确定检验项目,验证假设为以后的分析结论提供证据,食物中毒采样意义,实验室检测结果是查明爆发原因的证据科学准确合理地采集、运送、保存标本直接影响实验结果的可靠性,食物中毒采样原则,目的明确代表性 典型性 重点突出 有的放矢适时性 把握时机程序性,食物中毒样品种类,剩余食品病人排泄物血液标本尸体解剖标本炊具类标本现场环境标本原料、半成品和成品从业人员标本,无菌操作采样,无菌操作：防止外界微生物的污染和病原菌扩散所采用的操作技术 食物中毒采样目的是检测标本的实际污染状况，故应严格避免由于采样对检品造成的新的污染。要求采样容器、用具、培养基需严格灭菌同时以无菌操作取样。,无菌操作采样,采样前用75
9、%酒精棉球进行手消毒或戴手套采样用棉拭子、盐水等要求经高压灭菌消毒采样容器要求密闭、内壁光滑、清洁干燥经高压消毒镊子、剪刀等用具，使用前在酒精灯灼烧灭菌后使用妥善保管消毒用品。生理盐水和运送培养基要定期更换。（常温一个月）,食物中毒采样方法-剩余食品,餐桌上病人吃过的最好。无菌操作用灭菌镊子夹取置于灭菌容器。用灭菌盐水冲洗盛装过可疑中毒食物的容器，收集洗涤水置于灭菌容器或使用沾有灭菌盐水的棉拭子涂抹盛装过可疑中毒食物的容器，置于盐水管内。体积较大的肉食、鱼类 表面消毒后取内部采样半成品和原料罐头：直接采样或取空盒送检无剩余食品时，采集餐厅48小时留样食品,食物中毒采样方法-生物标本,呕吐物、洗
10、胃液 取新鲜即时的，避免混入其他杂质和细菌，容器应保证无菌粪便：黏液或脓血部分，液状粪便采取絮状物1-2mL,成型便取蚕豆大小粪块（约5g）盛于灭菌容器，勿混入尿液或水。注意密封和标签肛拭子（直肠拭子法）：告知病人采样目的使其配合,食物中毒采样方法-生物标本,确定体位，询问有无肛肠疾病，确定是否适合肛拭子采样取出灭菌采便管观察有无破损站在病人侧位，瞩病人深呼吸放松以采便管用生理盐水浸湿后，插入肛门内35cm,转动360度后取出，插入运送培养基。观察病人情况有无出血等,食物中毒采样方法-生物标本,咽喉涂抹 令患者仰头张口、用压舌板压舌、将无菌棉拭子伸入口腔涂抹咽部数次，放入盐水管血液：无菌穿刺取
11、静脉血23mL 移入无菌试管中送检。,生物标本的采样时机,呕吐物、洗胃液 取新鲜即时的粪便（肛拭子）急性腹泻期及药前根据患者人数，决定采集数量咽喉涂抹：发病第一日，最迟不超过3日,最好在体温38度以上时采集血液：无菌穿刺静脉血。发病初期血液可做细菌培养。急性期（3天内）和恢复期（2周左右）各采血一次，制备血清，有助于感染型食物中毒诊断。,食物中毒采样方法工用具标本,锅、盆、桶、刀、菜板 灭菌棉拭子沾盐水后反复涂擦，置于灭菌容器。棉拭子接触手的部分及时用无菌镊子折断后置于盐水管中。如菜板已洗过，可刮下表面木屑置于灭菌容器。抹布可剪下一块置于灭菌容器。食堂环境涂抹：冰箱、水池等,食物中毒采样方法-
12、从业人员,对直接接触食品的厨师和餐厅工作人员，可根据不同目的做带菌检查。采集手(皮肤)涂抹、肛拭子等样本,食物中毒采样数量,标本保存要求,直肠拭子：48h内检测,保存于4;48h后检测，保存于70新鲜粪便：采集2h后冰箱保存 脑脊液、尿液、唾液（24h内处理）可室温保存，长期保存条件4-8,标本保存要求,分离病毒标本：保温容器（0-4）不可超过2天。无条件立即运送和分离，需冻存。检测抗体的血清：4可保存710天，最好不要冷冻，防止反复冻融使用冰袋保持样品运送温度48 保证-20 条件应使用2kg干冰,病原微生物样本的包装,WHO传染性物质和诊断性标本的安全运送指南确保人员安全和标本完整使用三个
13、包装层对包装物进行三层包装防漏、吸附材料标签标识,病原微生物样本的运送,固定备有吸水材料、消毒剂、手套、口罩、密封防水废弃物容器车载冷藏装置、冰袋、冰壶等及时、专人、快速送检,采样注意事项,样品应做详细记录，体现样本全部信息根据不同样本性状，检验项目要求，合理保存和运送样品。一般要求4小时内送到实验室。夏秋季冷藏运送。样品采集时注意无菌操作，防止污染采样量不受常规采样数量限制。检验目的明确重点突出,食物中毒标本的送检与保存,为避免样本变质和样本中微生物增殖或死亡，送检时间越快越好。运送培养基中运送并保持于合适温度最好在采样后4小时内送检，最好冷藏运送。血液标本低温保存，不可冷冻 包装完整，密封
14、良好，标识清晰,采样基本生物安全注意事项,采样前进行手消毒或带手套避免接触不同患者时重复使用手套，防止交叉污染必要时穿防护服，采便时戴口罩废弃物处理依生物安全相关规定执行,检验项目选择,根据本起食物中毒临床和流行病学资料分析初步推断致病因素性质和中毒原因（建立假设）确定检验项目,初步假设,发病时间临床表现：发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻人群分布“三间分布”趋势 病例之间有食物同源性，食用者发病、不吃者不发病，停止进食发病即停止，为“剑锋”,初步判断,接报后通过初步分析和假设得出初步判断是否是一个事件？什么性质的事件？事件涉及范围及严重性？事件的发展趋势？爆发？流行？有无危重病人？需配合采取何措施
15、？如何调动人力？准备哪些个人防护、仪器设备？,检验项目选择,假设的特征 合理 有现场调查事实支持 能够解释大多数病例 注意现场观察，保持开放性思维，请教相关领域专家,目前食物中毒采样的偏差,广泛性采样，缺乏针对性盲目性（采集现场所有样本，做全项致病菌检测）大海捞针采样不全面，检测项目为固定模式缺乏沟通，前后脱节,致病物质不明食物中毒,食入可疑中毒食品引起的食物中毒由于取不到样品或已经无法查出致病物质在学术上中毒物质不明 诊断依据流行病学调查资料病人潜伏期和特有临床表现,致病物质不明食物中毒,报告迟赴现场迟、不能及时采样不能采集到关键样本或病人已用药检测项目针对性不强实验室能力,致病物质不明食物
16、中毒,分离不到病原性微生物可能的原因有 L型细菌技术和设备的原因病原性微生物的数量很少，培养不出来细菌处于非可培养的状态 现有的培养基和培养技术不适合这种微生 物的生长 新的病原微生物？,细菌性食物中毒实验室检验原则,尽快找到病原，快速准确允许与传统方法不一致,实验室应急准备,实验室必须常规配备各类样品的采集材料、常用的培养基、微量生化管或生化试剂条、常用的诊断血清，并保证在有效期内对不常用的采样材料，细菌鉴定所用的试剂、试纸条也应适量储备从事细菌性食物中毒检验工作的检验人员需经过专业知识和专业技能的学习，并能胜任检验工作的实际需要。,细菌性食物中毒实验室应急检测程序,初步检验直接涂片检查（霍
17、乱弧菌、弯曲菌）活菌数测定 蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌等分离培养 初筛 纯培养 全面鉴定细菌鉴定 生化、血清、分子生物学抗体测定 血清凝集效价毒素检测 免疫学、仪器法、PCR、动物实验,细菌性食物中毒实验室应急检测程序,应用直接分离及增菌双重培养,直接分离可检出样品中的优势菌(包括一些条件致病菌)增菌可将样品中污染的但与菌量较少的致病菌检出对服药患者肛拭样品中被抗生素抑制的细菌达到复苏和增加菌量的作用。,检样处理,生物样本一般不需要预增菌 但服用抗生素的检样需要预增菌，直接插入2mLTSB 3746h 按检验方法要求接种相应增菌液，再转种相 应培养基,初筛方法,三
18、糖铁PCRVIDASBAX,直接培养将处理后的检样直接接种于各种培养基上 需氧培养 普通琼脂平板 蜡样芽孢杆菌及其他未知菌 血平板 葡萄球菌、链球菌、蜡样芽孢杆菌 伊红美蓝培养基 大肠埃希氏菌、变形杆菌 麦康凯培养基 大肠埃希氏菌、变形杆菌 HE、SS培养基 沙门氏菌、志贺氏菌 TCBS培养基 副溶血性弧菌 厌氧培养 葡萄糖血琼脂平板 产气荚膜梭菌、肉毒梭菌 CCDA 空肠弯曲菌,增菌培养（与直接培养同时进行）需氧菌增菌培养基 7.5%NaCl肉汤 金黄色葡萄球菌 葡萄糖肉浸液肉汤 溶血性链球菌 TTB、SC增菌液 沙门氏菌 志贺氏菌增菌液 志贺氏菌 3.5%NaCl APW 副溶血性弧菌 肠
19、道菌增菌液 EC 病原性大肠埃希氏菌 厌氧菌增菌 庖肉培养基 产气荚膜梭菌、肉毒梭菌,血清学试验 将病人急性期和恢复期的血清与所分离的病原菌做试管凝集试验，如恢复期血清凝集效价较发病初期有4倍以上升高，则有诊断价值。毒素检测及动物试验 依食物中毒种类而定，目的是确定分离菌株的致病力。,动物实验在证实可疑食品（或分离菌株及其毒素）与该起食物中毒的关系时，是一个重要指标，特别是对某些条件致病菌引发的食物中毒尤为重要。常用动物有大白鼠、小白鼠、家兔、猫、猴等。给毒途径有经口灌胃、腹腔注射或结肠袢试验。液体食品可直接灌胃或注射；固体食品需经无菌水研磨浸出毒性物质，离心后取上清液进行试验。也可用分离菌株
20、培养物或其滤液进行试验。观察时间一般36天。每次试验必须设对照组。,动物实验,毒力基因检测,金黄色葡萄球菌肠毒素ELASAETEC侵袭毒素、ETEC肠毒素、副溶血性弧菌蜡样芽孢杆菌肠毒素、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌毒素PCR,检验结果判定原则,以找到病原体或其毒力基因为最终结论快速检测结果仅供参考注意非病原检样与病原检样检出病原菌的一致性,判定原则,多数患者样本中检出的致病意义明确的细菌在其种类、生化、血清型、毒素型均一致时，可以报告非病原检样与病原检样检出占有绝对优势的致病意义不甚明确的细菌（大肠杆菌、溶藻弧菌。）且细菌种类、生化血清型均一致，同时本次事件中非患者对照未检出时，应加做毒力、动物试
21、验，阳性结果可以报告,判定原则,样本中检出致泻大肠杆菌、金葡时，一定要做肠毒素检测为最终结论蜡样芽胞杆菌、产气荚膜梭菌必须计数105cfu/g以上,食物中毒检验重要的筛检试验,氧化酶 分辨革兰氏阴性杆菌中的肠杆菌科及弧菌科（氧化酶阳性）两类细菌触酶分辨葡萄球菌和链球菌,沙门氏菌,有动力（除鸡-雏沙门菌）大多产硫化氢（除甲型副伤寒）产酸大多产气（除伤寒、鸡-雏沙门菌）靛基质-蔗糖-乳糖-甘露醇+葡萄糖+符合肠杆菌科特征,初步生化:三糖铁（TSI）,沙门氏菌,血清凝集：A-F多价 O H1 H2如生化结果为沙门菌属但A-F多价 阴性考虑Vi 抗原遮蔽，煮沸后再凝亚利桑那菌：迟缓发酵乳糖，延长平板培
22、养时间可能使A-F以外的沙门菌可能是血清交叉凝集的柠檬酸杆菌,结果报告方式,A群：甲副 1,2,12;aB群：乙型副伤寒 1,4,5,12：b:1,2 鼠伤寒 1,4,5,12：i:1,2C群：丙型副伤寒 6,7，vi:c:1,5 猪霍乱6,7：c:1,5D群：肠炎沙门菌 菌1,9,12：g,m 伤寒沙门菌 1,9：vi:d,志贺氏菌,无动力，乳糖-（除宋内迟缓发酵乳糖）不产硫化氢，产酸不产气（除F6）靛基质多数阳性（宋内-）甘露醇+（痢疾志贺-）如生化结果为志贺氏菌属，四种多价不凝 K抗原遮蔽，煮沸后再凝EIEC 补充生化ONPG 产气试验等,志贺氏菌,宋内的R相，使用R相血清凝集蜂窝哈夫尼
23、亚菌，做大生化鉴定类志贺邻单胞菌 动力 氧化酶试验,细菌革兰氏染色形态,常用快速检测技术,显色培养基 利用细菌专有酶进行快速筛选 沙门、金葡、大肠、弧菌、单增 等 3M测试片细菌微量快速鉴定（手工API）标准化，缩短检测时间自动生化鉴定：AMS ATB BioLog直接从标本中检测抗原ELISA 放免分析（RIA)酶免分析（EIA)化学发光（CIA)生物发光 VIDAS 胶体金技术,细菌毒力基因快速检测,比细菌培养方法更可靠ETEC LT(热敏毒素）ST（耐热毒素）EHEC VT/SLT 副溶：TDH金葡：肠毒素BAX IQ-Check 普通PCR荧光定量PCR（实时、多重PCR）,常见食物中毒病原菌,常见食物中毒病原菌,Thanks,
