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1、免疫诊断Immunodiagnosis,免疫系 王巍,免疫诊断(Immune diagnosis),概念 利用免疫学原理进行临床疾病的诊断或辅助诊断,抗原抗体反应的高度特异性-亲和力抗原抗体反应的可逆结合-解离度 抗原抗体反应需要合适的浓度和比例-可见性抗原抗体反应的两个阶段：（1）特异性结合-非共价，肉眼不可见，几秒-几分钟（2）可见性反应-电荷吸引，肉眼可见，数小时-数天,一、抗原或抗体的检测（一）、抗原抗体反应的特点,抗原抗体比例合适温度：37度酸碱度：pH 6-8电解质：失去表面电荷,抗原抗体反应的影响因素：,（二）、检测抗原或抗体的方法,1.凝集反应（agglutination)：颗
2、粒性抗原与相应抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团块,直接凝集反应：颗粒性抗原+相应抗体 ABO血型测定间接凝集反应：可溶性抗原+颗粒载体+相应抗体,2.沉淀反应(precipitation)：可溶性抗原与相应抗体结合出现沉淀物,单向免疫扩散：可用于检测血清中Ig的含量双向免疫扩散：抗原抗体的定性分析免疫电泳：常用于血清蛋白种类分析免疫比浊：,单向免疫扩散,双向免疫扩散,Ag,+,-,免 疫 电 泳,3.用标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应,酶免疫测定：酶标记抗体进行的抗原抗体反应 酶联免疫吸附试验(ELISA)：将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行
3、。它将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。,双抗体夹心法 检测待测抗原间接法 检测待测抗体BAS-ELISA（生物素-亲和素系统-ELISA）酶联免疫斑点试验(ELISPOT)免疫组化技术,放射免疫测定法（radioimmunoassay,RIA）：放射性核素标记抗原或抗体，131I、125I,化学发光免疫技术（chemiluminescence immunoassay,CLIA）：化学发光物质标记抗原或抗体，鲁米诺,免疫胶体金（immunological colloidal gold signature,ICS）：胶体金颗粒标记抗原或抗体，氯金酸（
4、HAuCl4）,免疫印迹技术（immunoblotting,western blotting）：十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）后转膜孵育一抗二抗,二、免疫细胞的测定分析免疫细胞的数量和功能，评价病人的免疫功能包括CD分子测定、淋巴细胞转化、吞噬实验、细胞毒实验等,（一）、淋巴细胞的分离与类型鉴定分离方法：密度梯度离心 单个核细胞,磁珠分离：抗体与磁珠交联免疫吸附分离法：将已知抗体包被培养皿，加入淋巴细胞悬液荧光激活细胞分选仪分离法（FACS）抗原肽-MHC分子四聚体技术,磁珠分离法：磁珠标记的抗体,流式细胞分选仪（FACS）,（二）、免疫细胞功能测定：,T细胞功能测定B
5、细胞功能测定吞噬细胞功能测定,T细胞功能测定：,T细胞增殖试验细胞毒试验细胞因子检测皮肤试验,3H-TdR 掺入法：氚标记的胸腺嘧啶核苷，掺入新合成的DNA中，增殖越多3H-TdR掺入越多2.MTT法 3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，被琥珀酸脱氢酶还原为紫褐色颗粒,细胞增殖的检测法：,细胞毒实验：细胞形态：台盼蓝染色51Cr的释放LDH释放,凋亡细胞检测法：细胞形态：琼脂糖电泳:DNA ladder bandFACS:DNA 断裂为非二倍体TUNEL：TdT-dUTP 连接着色 DNA 3断裂末端,死细胞,细胞因子的检测,生物活性检测法：CTLL 细胞株 IL-2 依
6、赖 增殖 vs 细胞因子含量免疫学检测：ELISA ELISPOT,B细胞功能测定,Ig定量：单向琼脂扩散、免疫比浊法、ELISAB细胞增殖试验抗体形成细胞测定：溶血空斑实验,吞噬细胞功能测定,趋化功能测定（Boyden 小室）吞噬功能测定 硝基蓝四氮唑 NBT淡黄色经超氧阴离子O2-变为蓝黑色颗粒 荧光标记的生物颗粒、天然有色颗粒（鸡红细胞）,三、免疫学检测方法的应用,疾病的诊断：感染性疾病 超敏反应性疾病 自身免疫病 免疫缺陷病 肿瘤免疫学监测：,免疫学防治Immunoprophylaxis and immunotherapy,一、免疫预防,疫苗的基本要求:安全 有效 实用,自然免疫：机体
7、感染病原体后建立的特异性免疫，包括胎儿或新生儿经胎盘或乳汁从母体获得抗体。疫苗（vaccine）：一些能够诱导机体产生特异性免疫的人工主动免疫制剂如细菌性制剂、病毒性制剂以及类毒素等统称为疫苗。人工主动免疫:用疫苗接种机体使之产生特异性免 疫,从而预防感染的措施。人工被动免疫：给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞因子等制剂，以治疗或紧急预防感染的措施。,人工主动免疫 减毒活疫苗：免疫原性强，类似轻症感染，只需接种一次。卡介苗、脊髓灰质炎、麻疹、风疹疫苗 灭活疫苗（死疫苗）：免疫原性强，理化灭火，诱导特异性抗体的产生，无法诱导CTL，需接种多次。狂犬病、伤寒、流感疫苗 类毒素：细菌的外毒素经0
8、.3%-0.4%甲醛处理，诱导机体产生抗毒素。白喉、破伤风,人工被动免疫 抗毒素：用细菌外毒素或类毒素免疫动物制备的免疫血清，具有中和外毒素的作用。破伤风抗毒素、白喉抗毒素 人免疫球蛋白制剂：从大量混合血浆或胎盘血中分离制成的免疫球蛋白浓缩剂。甲型肝炎、丙型肝炎、麻疹、脊髓灰质炎等疾病的预防 细胞因子和单克隆抗体,佐剂（adjuvant)：预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强物质。,增加局部抗原浓度刺激单核-巨噬细胞系统，增强抗原处理和提呈能力刺激淋巴细胞增殖分化,常用佐剂：氢氧化铝 ISCOMs（免疫刺激复合物）含CpG寡核苷酸 细胞因子
9、,新型疫苗,亚单位疫苗：有效免疫原成分制成的疫苗，如乙型 肝炎病毒表面抗原制成的乙型肝炎疫苗结合疫苗：细菌夹膜多糖+白喉类毒素（脑膜 炎球菌、肺炎球菌疫苗已获准使用）合成肽疫苗：疟疾疫苗、肝癌疫苗处于临床试验阶段,基因工程疫苗 重组抗原疫苗：乙型肝炎疫苗获准使用重组载体疫苗,DNA疫苗：用编码有效免疫原的基因与表达质粒构建重 组体直接免疫机体。转基因植物疫苗：将编码有效免疫原的基因导入可食 用的植物细胞基因组中，使其在植 物的可食用部分稳定表达，通过摄 取食物达到免疫接种的目的。,我国计划免疫程序,许多疾病无有效疫苗：病毒：HIV，疱疹病毒 细菌：葡萄球菌，A组链球菌 真菌：假丝酵母 原生动物
10、：疟疾，利什曼病 蠕虫感染：血吸虫病,疫苗的应用,传染病抗肿瘤计划生育防止免疫病理损伤,二、免疫治疗（Immunotherapy）利用免疫学原理，针对疾病的发生机制，人为地调整机体的免疫功能，达到治疗母的所采取的措施。免疫抑制、免疫增强主动或被动特异或非特异,（一）、分子治疗分子疫苗：合成肽疫苗、重组载体疫苗和DNA 疫苗可作为肿瘤和感染性疾病的治疗性疫苗抗体：多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体3.细胞因子：外源性细胞因子治疗、细胞因子拮抗疗法、微生物抗原疫苗4.微生物抗原疫苗,1）多克隆抗体 在临床应用的多克隆抗体包括：胎盘球蛋白、丙种球蛋白、破伤风抗毒素、白喉抗毒素、抗淋巴细胞抗血清、抗
11、Rh抗体、抗SARS病毒抗体等2）鼠源单克隆抗体 在临床应用的鼠源单克隆抗体：抗CD3（OKT3）：抗器官移植排斥 抗CD20：治疗B细胞淋巴瘤3）基因工程抗体 基因工程抗体已经成为治疗性抗体的主流产品。包括：嵌合抗体（chimeric Ab)人源化抗体（humanized Ab）人抗体,抗体药物,基因工程抗体,鼠源单克隆抗体治疗存在的主要问题是HAMA（Human anti-mouse antibody）反应，导致疗效下降，副作用增加。,抗细胞因子及其受体抗体 抗TNF及其受体的抗体治疗类风湿关节炎 抗IL-2及其受体治疗自身免疫病和抗移植排斥 抗VEGF抗体治疗肿瘤 抗EGFR2、EGFR
12、1抗体治疗肿瘤,抗CD分子抗体 抗CD20嵌合抗体治疗B细胞淋巴瘤 抗CD33治疗急性髓性白血病 抗CD52治疗淋巴瘤 抗CD11a治疗银屑病,抗体药物的主要问题,临床用量大成本高，价格昂贵生产工艺复杂，硬件设备高投入治疗性免疫靶标的鉴定有很大难度存在临床风险,美国FDA已批准生产和临床使用的单克隆抗体（截至2011年）,批准上市的重组细胞因子药物,IFN 白血病、肝炎、Kaposi肉瘤 IFN 类风湿关节炎、慢性肉芽肿、生殖器疣 G-CSF 自身骨髓移植、化疗导致的粒细胞减少症、再生障碍性贫血 GM-CSF 自身骨髓移植、化疗导致的血细胞减少症、再生障碍性贫血 Epo 慢性肾衰导致贫血、癌症
13、或癌症化疗导致的贫血、失血后贫血 IL-2 癌症、免疫缺陷、疫苗佐剂 IFN 多发性硬化症 IL-11 放化疗所致血小板减少症 SCF 与G-CSF联合应用与外周血干细胞移植 PDGF 糖尿病导致的皮肤溃疡 EGF 外用药治疗烧伤、溃疡（仅在中国上市）bFGF 外用药治疗烧伤、外周神经炎（仅在中国上市）TNF 局部灌注治疗晚期骨髓瘤（仅在德国上市）TNF突变体 晚期肿瘤（仅在中国上市）Tpo 治疗血小板减少症（仅在中国上市）,重组蛋白质药物,批准上市的重组可溶性受体药物,可溶性TNF受体-Ig（Enbrel）：治疗类风湿关节炎（Amgen),2006年销售额超过45亿美元,可溶性CD152-I
14、g CTLA4-Ig）:商品名Abatacept，治疗自身免疫病（Bristol-Myers Squibb）,2005年12月批准上市,重组蛋白质药物的主要问题,半衰期短，需要反复给药能够诱导抗体产生,基因治疗,将正常人体基因通过 in vivo 或 ex vivo的途径导入病人体内，通过体内表达正常基因治疗疾病。,Ashanti de Silva,was the first patient to be treated with gene therapy.,重症联合免疫缺陷（SCID）的基因治疗 腺苷脱氨酶（ADA）基因治疗(1990),XSCID的IL-2受体链基因治疗性联SCID的发病是由
15、于IL-2R基因缺陷2000年法国科学家在Science首次报道2例成功基因治疗的结果；至2002年法、英、美共治疗14例，12例成功。,第一例成功接受IL-2R基因治疗的男孩Rhys Evans,XSCID 基因治疗原理,基因治疗的主要问题,病毒载体的安全性靶基因选择基因导入效率基因的可调控表达,（二）、免疫细胞治疗,细胞疫苗：肿瘤细胞疫苗：灭活瘤苗、异构瘤苗。自体或同种肿瘤细胞经理化方法处理，抑制其生长保留其免疫原性。基因修饰的瘤苗：用基因修饰的方法改变肿瘤细胞的遗传性状，降低致瘤性，增强免疫原性树突状细胞疫苗：使用肿瘤提取物抗原或肿瘤抗原多肽等体外刺激树突状细胞，或用携带肿瘤相关抗原基因
16、的病毒载体转染树突状细胞，再回输给患者，可有效的激活抗肿瘤免疫应答,取自体淋巴细胞经体外激活、增殖后回输患者，直接杀伤肿瘤或激发机体抗肿瘤免疫效应，即过继免疫（Adoptive immunity）CIK（cytokine induced killer）:外周淋巴细胞经 PHA+IL-2+IL-1等多种细胞因子诱导培养 TIL（tumor infiltrating lymphocyte）：肿瘤中 T 细胞经体外 IL-2 诱导培养,过继转移：,移植所用干细胞来自于 HLA 型别相同的供者，采集CD34+干细胞 1.骨髓 2.外周血 3.脐血,造血干细胞移植：,免疫细胞治疗的主要问题,疗效不稳定，不同个体反应不同只能采取个体化治疗，不能工业生产，质量控制有难度成本高，价格昂贵,（三）、生物应答调节剂和免疫抑制剂,天然动植物药物,免疫增强剂：黄芪、茯苓、枸杞等,生物应答调节剂：具有促进或调节免疫功能的制剂，通常对免疫功能正常者无影响，而对免疫功能异常，特别是免疫功能低下者有促进或调节作用,免疫抑制剂,化学合成药物 糖皮质激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤2.微生物制剂 环孢素A（CsA)、FK506、麦考酚酸酯、雷帕霉素3.来源于动植物的免疫抑制剂 苦参、雷公藤等,常用于防止移植排斥反应的发生和自身免疫病的治疗,谢谢！,
