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1、酶 学,彭益强,Enzymology,国立华侨大学生物工程与技术系,第一节 单底物反应动力学第二节 抑制作用动力学第三节 多底物反应动力学第四节 别构酶动力学第五节 pH和温度对酶催化反应速度的影响,主要内容,第四章 酶催化反应动力学,第四节 别构酶反应动力学,酶与一般催化剂不同的特点：可调节性；30%酶动力学不符合米氏方程，大多是寡聚酶，受代谢物调节，但代谢物结构不类似于被调节酶底物；60年代，Jacob与Monod提出别构理论，反馈调节作用称为别构效应。非唯一调节方式，却是较为重要的一类。,例子,ATC酶经过温和的化学处理，如用对羟基汞苯甲酸（PCMB）处理可解聚为两个催化亚基（为三聚体）
2、和 3个调节亚基（为二聚体）。催化亚基仍有催化活力，但不再受效应物影响，调节亚基无催化活力，但仍能结合效应物。更剧烈的处理，如用十二烷基硫酸钠（SDS）处理，则催化亚基和调节亚基都各解聚成6个单体,主要内容,一、配体（底物）与蛋白质结合中协同效应(link)二、别构酶的性质、结构及动力学特性(link)三、别构效应(link),go,一、配体（底物）与蛋白质结合中协同效应,指蛋白质与一个配体（底物和效应物）结合后可影响蛋白质与另一个配体结合能力；据此分类：1，正协同效应-激活；2，负协同效应-抑制；3，同促效应（同种协同效应,homotropic effect）一个配体与酶结合后，引起酶分子构
3、象变化，从而改变 后续相同配体对酶的亲和力；4，异促效应（异种协同效应,heterotropic effect）一种配体与酶结合引起另一种配体对酶亲和力的改变；多数别构酶兼有同促效应和异促效应。,（一）协同效应,（二）配体与蛋白质结合,E+S ES结合常数：Kb=ES/ES,Kb=K-1S,蛋白质饱和分数Y：E0恒定下，Y对S作图为一双曲线；在稳态下，亦是一双曲线。此是米氏方程特性!,1、与具单个结合部位的蛋白质结合,2、与具多个结合部位的蛋白质结合,最简单情形：二聚体蛋白两个相同配体结合位，同种正协同作用：M2+2S M2S2结合常数:Kb=M2S2/M2S2蛋白质饱和分数：Y=M2S2/（
4、M2）0=KbS2/(KbS2+1)YS,是S形曲线,Hill方程,结合常数取对数：更普通地，n个相同结合位之蛋白质通式：即为Hill方程；理想条件下Lg(Y/(1-Y)lgS作图；即为Hill曲线图，线性，斜率为n，纵截矩lgKb；实验中测定的斜率n为Hill系数h;,例：血红蛋白Hill系数,多结合位蛋白与配体之间的结合研究是基于氧和血红蛋白结合之研究；1904，Bohr,绘制了血红蛋白与氧结合的饱和分数Y对氧分压的图形，是S形曲线；1909,Hill基于结合部位之间相互影响引起正协同效应来解释此曲线；若血红蛋白有n个亚基，总反应式：Hb+nO2 Hb(O2)n在基础上推导出Hill方程；
5、做为含有4个氧结合位的血红蛋白，其斜率应为4,血红蛋白S形氧合曲线,虽与实验数据有偏，但此方程很好地适合了血红蛋白氧合曲线及其它别构蛋白的协同过程，因此其数据处理方法即Lg(Y/(1-Y)lgPO2作图法（Hill作图法）得到应用。血红蛋白氧合具高协同性，因此极高或极低氧下只结合一个氧分子，两端斜率为1;中间氧浓度区协同性最好大，h=2.8,但曲线斜率总不会达4这个亚基数；目前其结构基础已初步阐明：1960，Perutz，4个结合位血红素完全分离，相互作用不可能，可能是亚基间作用，氧合中4个氧结合也不一样，第一个需打开盐键更多些，第4个更少，故呈S形曲线！,血红蛋白H illl图,back,二
6、、别构酶的性质、结构及动力学特性,别构作用：指不同于底物的物质对酶起到激活或抑制作用；别构酶：具不止一个配基结合位的酶，活性位外的部位可与和底物结构完全不同的物质结合，结合后通过构象变化影响底物与活性位的作用从而对酶催化产生正或负影响；发现起源：反馈调节；1，50年代，Umbarger,L-苏氨酸到L-异亮氨酸五步反应，当异亮氨酸过量则对第一步酶苏氨酸脱水酶产生反馈抑制！2，Gerharf嘧啶核苷酸合成途径中发现终产物CTP抑制第一步酶，天冬氨酸转氨甲酰酶（ACTase)。,（一）别构酶性质和结构,某些酶的分子表面除活性中心外，尚有调节部位，当调节物（或称别构物）结合到此调节部位时，引起酶分子
7、构象变化，导致酶活性改变，这类酶称为变/别构酶。,3.6 重要的酶,3.6 重要的酶,变构酶与变构调节,概 念,变构酶又称为别构酶，指酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后，引起酶的构象的改变，进而改变酶的活性状态，酶的这种调节作用称为变构调节(allosteric regulation)，具有变构调节的酶称变构酶(allosteric enzyme)。凡能使酶分子发生别构作用的物质称为变构剂(effector)。变构酶多为寡聚酶，含的亚基数一般为偶数；且分子中有催化部位（结合底物）与调节部位（结合变构剂），这两部位可以在不同的亚基上，或者在同一亚基的两个不同部位。,效应物（effe
8、cter）不作用于活性中心，而是活性中心以外的部位，引起分子构象变化，来调节酶活力。此效应物为别位效应剂(allosteric effecter),3.6 重要的酶,特点：一般为寡聚酶 有别构位和催化位 作用曲线往往为S形,别构酶结构特性：,（1）有多个亚基（2）有四级结构（3）酶分子中除了有结合底物并催化反应的活性中心外，还有可以结合调节物的别构中心。活性中心和别构中心可能位于不同的亚基或相同的亚基的不同部位。（4）活性用于结合底物，别构中心用于调节速度；（5）有时因物理化学作用脱敏，但正常催化活性未失，表现出米氏方程双曲线动力学特征。,（二）动力学特性,与米氏曲线比较：注意：别构酶往往具有
9、S曲线特征，但反之不亦然！,3.6 重要的酶,S形曲线动力学特征,S形曲线有利于反应速度的调节！与米氏曲线比较：因此S曲线体现为当底物浓度发生很小变化时，别构酶可以极大程度控制反应速度,3.6 重要的酶,变构酶作用特点,1、一般变构酶分子上有二个以上的底物结合位点。当底物与一个亚基上的活性中心结合后，引起酶分子构象的改变，使其它亚基的活性中心与底物的结合能力发生改变，或出现正协同效应(positivecooperative effect)，或出现负协同效应（negative cooperative effect）。,2、正协同效应的变构酶其速度-底物浓度曲线呈S形，即底物浓度较低时，酶活性的增
10、加缓慢，底物浓度高到一定程度后，酶活性显著加强，最终达到最大值Vmax。如大肠杆菌的天冬氨酸转甲酰基酶（ATCase）对底物天冬氨酸的结合表现为正协同效应。,3.6 重要的酶,3、负协同效应的变构酶其速度-底物浓度曲线为类似双曲线。底物浓度较低时，酶表现出较大活性，但底物浓度明显增加时，其反应速度无明显变化。如3-磷酸甘油醛脱氢酶对NAD+的结合为负协同效应，其意义在于无论细胞内酶的底物浓度如何变化，酶始终能以一个较恒定的速度进行以满足细胞的基本需要。,3.6 重要的酶,4、变构酶除活性中心外，还存在着能与变构剂作用的亚基或部位，称调节亚基(或部位)。变构剂与调节亚基以非共价键特异结合，可以改
11、变调节亚基的构象，进而改变催化亚基的构象，从而改变酶活性。凡使酶活性增强的变构剂称变构激活剂(allosteric activitor)，它能使上述S型曲线左移，饱和量的变构激活剂可将S形曲线转变为矩形双曲线。凡使酶活性减弱的变构剂称变构抑制剂(allosteric inhibitor)，能使S形曲线右移。例如，ATP是磷酸果糖激酶的变构抑制剂，而ADP、AMP为其变构激活剂。,5、由于变构酶动力学不符合米-曼氏酶的动力学，所以当反应速度达到最大速度一半时的底物的浓度，不能用Km表示，而代之以K0.5S表示。,3.6 重要的酶,正协同效应的变构酶底物活性曲线,不加变构剂加变构激活剂 加变构抑制
12、剂,+,-,back,三、别构效应,别构效应（allosteric effect）：调节物或效应物与酶分子上的别构中心结合后，诱导出或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合和催化作用受到影响，从而调节酶反应速度及代谢过程，此效应即为酶的别构效应。,主要内容,1、别构效应生理调节功能;2、别构效应的类型判断法;3、变构酶活性调节的机理与模型.,1、别构效应生理调节功能,别构调节是快速影响酶活的一种重要方式,通常处于代谢途径之起点或分叉点或关键点、限速点；例1：天冬氨酸氨甲酰转移酶是起始点关键酶受CTP抑制和ATP激活；例2：胆固醇合成途径中部甲羟戊二酸C oA还原酶是其限速酶，终产物胆
13、固醇是其别构调节物；,协同效应之作用,正协同效应使得配体浓度在一定区间内酶反应速度对其变化非常敏感，而在区间外不敏感；例：同时受几种酶作用之底物参与几个代谢途径，底物流量分配可通过正协同效应别构酶实现，如氨甲酰磷酸受天冬氨酸氨甲酰转移酶正协同效应合理分配产CTP和Arg;负协同效应提供了配体浓度变化对酶反应速度不敏感区；例：若某底物许多酶均需要，此途径特别重要，负协同效应可使该途径稳定进行下去，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶对NAD+产生负协同效应，使之稳定产生而不管其它反应对NAD+的影响。,变构酶的动力学及变构酶对酶反应速度的调节,1.大多数变构酶具有正协同效应（酶分子结合一分子底物或效应物后，
14、酶的构象发生变化，这种新的构象有利于后续分子与酶的结合，大大促进后续分子与酶的亲合性），其初速度与底物浓度的关系呈S形的v-S曲线。,当底物浓度发生很小的变化时，变构酶就极大地控制着反应速度。在正协同效应中使得酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感。,2.另一类别构酶具有负协同效应，其动力学曲线在表现上与双曲线相似，但意义不同：具有负协同效应的酶在底物浓度较低的范围内酶活力上升快，但再继续下去，底物浓度虽有较大的提高，但反应速度升高却较小。使得酶反应速度对底物浓度的变化不敏感,3.6 重要的酶,生理意义及实例,1、在正协同效应的变构酶的S形曲线中段，底物浓度稍有降低，酶的活性明显下降，多酶体系催化
15、的代谢通路可因此而被关闭；反之，底物浓度稍有升高，则酶活性迅速上升，代谢通路又被打开，因此可以通过细胞内底物浓度的变化来灵敏地控制代谢速度。,2、变构抑制剂常是代谢通路的终产物，变构酶常处于代谢通路的入口，通过反馈抑制，可以及早地调节整个代谢通路，减少不必要的底物消耗。,3.6 重要的酶,3.6 重要的酶,例如葡萄糖的氧化分解可提供能量使AMP、ADP转变成ATP，当ATP过多时，通过变构抑制剂ATP抑制磷酸果糖激酶的活性，可限制葡萄糖的分解，而ADP、AMP增多时，则可通过变构激活剂AMP、ADP激活磷酸果糖激酶的活性促进糖的分解。随时调节ATP/ADP的水平，可以维持细胞内能量的正常供应。
16、,3.6 重要的酶,3.6 重要的酶,2、别构效应的类型判断法,主要有以下3种：（1）vS（2）双倒数作图法（3）Hill作图法,（1）作图法,vS,又称米氏作图1,符合米氏方程的无协同效应，直角双曲线；2,S曲线的为正协同效应；3,非直角双曲线；,双倒数作图,即L-B作图法；1，无协同时直线；2，正协同上凸；3，负协同下；,Hill作图,对别构酶而言Hill方程：lg(v/(vmax-v)lgS作图斜率为n，纵截矩lgKs，横截矩（lgKs)/n;v=0.5vmax时S0.5,有：lgS0.5=1/nlgK0.5SS0.5相当米氏方程中的KmHill作图斜率称:Hill系数或协同系数，h表示
17、之，可知有：h=1 米氏类型酶h1 具有正协同效应的别构酶h1 具有负协同效应的别构酶,（4-66）,E+nS ESn E+nP,Hill系数,Hanes作图法,Eadie hofstee法,正协同 负协同 无协同,（2）协同指数,Koshland标准：CI（cooperativity index）协同指数：酶分子中的结合位点被底物饱和90%和10%时底物浓度的比值。亦称饱和比值Rs(saturation ratio),Rs=81 米氏类型酶Rs81 具有正协同效应的别构酶Rs81 具有负协同效应的别构酶,协同指数推导,由4-66可得：用v=0.9vmax,v=0.1vmax代入得：从而有：因
18、而有协同指数：,米氏方程 CI（Rs）=81 n=1正协同 CI（Rs）1负协同 CI（Rs）81 n1,3、变构酶活性调节的机理与模型,序变模型（KNF模型）描述异促效应更适合齐变模型(MWC模型)不适用于负协同,（1）MWC模型,1965,同Monod,Wyman,Changeux提出，同构模型，对称模型，定义：（1）寡聚体(oligomer)由一定数量但数目不大亚基组成；（2）相同亚基为原体（protomer);（3）单体指完全解离的原体；如两原体假设,不同构象状态亚基不利作用，故全是R（松弛高活性）或T（紧密低活性），两种构象状态在无配体时处于平衡,底物（配体）的结合打破此平衡，这样就
19、能对协同效应给解释！,MWC模型示意图,T态(对底物亲和力低),R态(对底物亲和力高),+S,+S,RR浓度R0，TT浓度T0；R0 T0平衡常数L=T0/R0；(1)当底物不与T态酶结合时:R0+S R1 R1+S R2KR微观解离常数：KR=2SR0/R1 R1=2(S/KR)R0KR=SR1/2R2 R2=(S2/KR2)R0饱和分数YS=被底物占据的活性位/总活性位则有：相应式子代入有：,提示:进行书面推导:,设=S/KR,(4-76),(2)T状态也可和配体结合，解离常数KT：KT=2ST0/T1 KT=ST1/2T2；一般地，n个亚基聚体，第i个配体结合时，有：KT类似；设c=KR
20、/KT,a=S/KR则处于R态的酶为：T态酶亦然；配体占据总活性位饱和分数：,提示:进行书面推导,C,当n=2时:,KT=2ST0/T1 KT=ST1/2T2,(4-81),C,MWC模型解释,其协同效应是基于Rn/Tn的平衡；无配体时，L很大，趋向T态；配体浓度较高时，Rn/Tn平衡受到扰动，更多Rn从Tn生成，产生更多的RnS，RnS2络合物直至Tn全部转变成Rn,因此整个结合曲线是S型，是正协同效应特征；不能解释同种负协同效应,MWC模型,（2）KNF模型,1966年Koshland,Nemethy,Filmer提出，渐变模型；不同点：（1）无底物时不存在R0-T0的平衡,T到R是配基的
21、诱导;（2）若由n全亚基构成,则由T到R态不是同时进行的,存在RT状态;（3）可以是正或负协同效应;,以二亚基酶为例，O表示T态，口表示R态，KtTR,T到R的平衡常数;KSR,S与R结合的平衡常数;KTR,S与T结合的络合常数;过程如下：,KNF模型,形态与教材规定的相反!,以OO为标准态,相对浓度为1,如要计算浓度则有:,令KTT=1 则有:,(1),(2),(3),(4),+,KTT,代入上式:,概率因素2,(A),其它形式的酶相对浓度:,=1,推导:,=KRR,S,S,=KRR,S,KTR,KTR,=,代入(A),代入以上各项式有:用YS也得S形曲线;MWC,KNF都只考虑了最简单情况
22、(教材图4-46所示)。,酶活性中心被配基饱和的分数为:,MWC和KNF模型结合 通用模式,无论有无配体存在，亚基构象的改变都能发生。同样酶分子中，可存在不同构象亚基的杂交体。两种不同的构象都能顺序地与配体结合。,3EIG模型式(Eigen模式),back,别构酶实例,大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶（E.coli aspartate transcarbamylase,ATCase）,(1)嘧啶合成途径的第一个酶；ATP正激活；CTP负抑制,ATCase：MW=310，000 由12条肽链组成；两类亚基：大亚基催化亚基，对ATP、CTP无作用；小亚基调节亚基，可结合ATP、CTP，但无催化活性；,催化亚基（三聚体）调节亚基（二聚体）,每个催化亚基上有三个Asp的S结合部位。（三聚体每条肽链上有一个）每个调节亚基上有两个别构效应剂（CTP、ATP）结合部位（二聚体每条肽链上有一个），研究发现 S、ATP、CTP都可使ATCase产生别构效应。（3）研究还发现 ATCase与S结合，它就肿涨（swelling）成为R态；而当ATCase与CTP结合它就收缩成T态。,(2)ATCase活性调节的机理,有催化活性的构象,无催化活性的构象,PART END,
