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1、第三章 动物细胞制药,动物细胞的结构较原核细胞复杂得多，而且以不是靠一个细胞包办一切生理活动，各细胞都有明确的分工。为了适应其功能需要，细胞的形态也有了相应的变化，我们称这种变化为分化。如：红细胞呈圆盘形；神经细胞呈纤维形。然而当细胞离体培养时这些分化的形态经常会发生变化。我们通常将离体培养的细胞分为：贴壁依赖型（贴壁细胞）和贴壁非依赖型（悬浮细胞）。,一、动物细胞的形态和生理特点,贴壁细胞 这类细胞的生长必须有给你贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖。当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞型或上皮细胞型。这些细胞形态不是绝对的，
2、它随培养条件的变化而有所变化。,一、动物细胞的形态和生理特点,悬浮细胞 这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长。,一、动物细胞的形态和生理特点,兼性贴壁细胞 这类细胞并不严格地依赖支持物表面生长，一定条件下，它们还可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长。这类细胞称之为兼性贴壁细胞。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生理特点细胞的分裂周期长 动物细胞分裂周期所需的时间一般为1248h，它不仅随细胞种属的不同而不同，同一种属，不同部位的细胞所需的时间也不同。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生理特点细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象 当细胞在基质上分裂增殖，逐渐
3、会合成片时，即每个细胞与其周期的细胞相互接触时。细胞就停止繁殖。此时若能保持充足的营养，细胞仍可存活相当一段时间。但细胞密度密度不再增加，所以该现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生理特点3.正常二倍体细胞的生长寿命是有限的 当细胞离体培养开始，我们称之为原代培养。以后经传代后，即成为有限细胞系。细胞经若干代传代培养后逐渐死亡，该时间的长短取决于细胞来源的种族和年龄。当细胞经自然的或人为的因素转化为异倍体后，该细胞即可转变为无限细胞系，或称连续细胞系。此时细胞的寿命将是无限的，因此更适合于工业化生产的需要。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生
4、理特点动物细胞对周围环境十分敏感 动物细胞比植物细胞的培养难度大得多，因为动物细胞膜外没有细胞壁保护，仅有一层很薄的粘多糖蛋白。因此动物细胞对渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生理特点动物细胞对周围环境十分敏感 动物细胞比植物细胞的培养难度大得多，因为动物细胞膜外没有细胞壁保护，仅有一层很薄的粘多糖蛋白。因此动物细胞对渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生理特点动物细胞对培养基的要求高 动物细胞对营养的要求高，不仅需要12种必需氨基酸，还需要多种细胞因子和贴壁因
5、子等才能生长，这种要求还随细胞种类的不同而不同。,一、动物细胞的形态和生理特点,动物细胞的生理特点动物细胞蛋白质的合成和修饰功能与细菌不同 动物细胞相对于原核细胞，它们多半是分泌在胞外的，收集纯化方便，得到了较完善的翻译后修饰，特别是糖基化，因此更与天然的产品一致，更适合于临床使用。,一、动物细胞的形态和生理特点,一、生产用动物细胞的获得原代细胞 原代细胞是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。,二、生产用动物细胞的要求和获得,一、生产用动物细胞的获得二倍体细胞系 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化某种具有一定特性的细胞株。该细胞株仍具备“正常
6、”细胞的特点：它的染色体组型仍是2n的核型；具有明显的贴壁依赖和接触抑制的特性；只有有限的增值能力，一般可连续传代培养50代；无致瘤性,二、生产用动物细胞的要求和获得,一、生产用动物细胞的获得3.转化细胞系 这类细胞是通过某个转化过程形成的，他常常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了正常细胞的特点，而获得了无限增值的能力。由于转化的细胞具有无限生命力，而且常常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，故更适于大规模工业化生产的需要。,二、生产用动物细胞的要求和获得,二、常用生产用动物细胞的特性WI-38：二倍体细胞系。该细胞是最早被认为是安全的传代细胞。在20世纪60年代广泛用于制备疫
7、苗。MRC-5:二倍体细胞系。被广泛用于人体疫苗的生产。CHO-KI:1957年从中国地鼠暖巢中分离的一株上皮样细胞，培养时需要加入脯氨酸。当前被广泛用于构建工程菌的是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株CHO-dhfr-。,二、生产用动物细胞的要求和获得,二、常用生产用动物细胞的特性BHK-2：二倍体细胞系。用于增值病毒和工程细胞的构建。Vero:贴壁依赖型的成纤维细胞。支持多种病毒的增值，已被批准用于人体。Namalwa:转化细胞系。被大规模地用于生物素干扰素。SP2/0-Ag14：被广泛用于单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗体的生产，近年来正被开发为生产其它药品的高表达宿主细胞。Sf-9：
8、目前被广泛用于高效表达外来的蛋白制品。,二、生产用动物细胞的要求和获得,三、基因工程细胞的构建和筛选真核细胞基因表达载体的构建 要将外源基因在动物细胞中高效表达，首先要将其构建在一个高效表达载体内。目前，一般使用的载体有两类：一类是病毒载体，如牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒和杆状病毒。另一类是质粒载体，而且常常是穿梭质粒载体。,二、生产用动物细胞的要求和获得,三、基因工程细胞的构建和筛选基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选 载体构建后，可用四种方法导入动物细胞，其中最常用的是磷酸钙沉淀法和电穿孔法，各种常用的方法见后表。,二、生产用动物细胞的要求和获得,表 DNA导入动物细胞的常用方法,二、
9、生产用动物细胞的要求和获得,四、细胞库的建立 除原代细胞外，其他的细胞株、细胞系，无论是二倍体细胞、转化细胞、还是融合细胞或经重组的工程细胞，一旦建立后都需建细胞库加以保存。按我国和美国FDA的规定，用于生产额工程细胞必须建立两个细胞库，即原始细胞库（master cell bank,MCB）和生物用细胞库(manufacturers working cell bank,MWCB)，或称工作细胞库(working cell bank,WCB)。,二、生产用动物细胞的要求和获得,营养成分 促生长因子 激素 渗透压 pH 无毒、无污染,三、动物细胞的培养条件和培养基,培养基的基本要求,1.营养成分
10、 氨基酸 氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸：缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱。此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。单糖 培养基中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡糖糖的吸收能力最高，半乳糖最低。,1.营养成分 生长因子 主要是辅酶、辅基，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。无机离子与微量元素 细胞生长除需要钠、钾、钙、
11、镁、氮、磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。,培养基的基本要求,培养基的基本要求,2.促生长因子及激素 各种激素、生长因子的功能 维持细胞的功能。保持细胞的状态（分化或未分化）有些激素对许多细胞生长有促进生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松促进表面细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。,培养基的基本要求,3.渗透压 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养基细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290 mOsm/kg，可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320 mOsm/kg 左右。大多数
12、哺乳动物细胞，渗透压在260320 mOs/kg 的范围都适宜。,培养基的基本要求,4.pH 大多数细胞适宜 pH为7.27.4 培养基应具一定的缓冲能力 造成pH波动主要是代谢产生的CO2，在封闭培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培养基pH很快下降。为解决这一问题，合成培养基中使用了Na2CO3-CO2缓冲系统，通过稳定调节温箱中CO2浓度（5%）,使之与培养箱中的Na2CO3处于平衡状态。,培养基的基本要求,5.无毒、无污染体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有任何抵抗能力。因此培养基应达到 无化学物质污染 无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）无对细胞产生损伤作用的生物活性物
13、质污染（如抗体、补体）对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配置过程，配置所用的水，器皿应十分洁净，配置后应严格过滤除菌。,培养基的基本要求,天然培养基血清的种类血清的主要成分和作用血清的质量标准血清的外观血清的使用与储存使用血清的优缺点,天然培养基天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。但是由于天然培养基的制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。,天然培
14、养基,血清的种类小牛血清 取自出生1030天的小牛新牛血清 取自出生24小时之内的新生牛胎牛血清 取自剖腹产的胎牛，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少,天然培养基,血清的主要成分和作用主要成分 血清是由血浆去除纤维蛋白质而形成的，血清中含有各种血浆蛋白、多肽。脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机盐等。主要作用 提供基本营养物质 提供激素和各种生长因子 提供结合蛋白 对培养中的细胞起到某些保护作用,天然培养基,血清的质量标准 血清质量高低取决于两方面因素：一是取材对象，而是取材过程。理化性质渗透压、pH、蛋白质电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量（不低于
15、35-45g/L）、球蛋白含量（应小于20g/L）、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指标。血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越高，血红蛋白也是越低越好。,天然培养基,血清的质量标准微生物检测包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测支原体是一种很小的微生物，可通过孔径22m的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难于察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响试样结果。检测支原体的方法很多，如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。,天然培养基,血清的质量标准促生长效果 这是血清重要的特性之一，应以培养的 细胞来检测克隆形成率 悬浮生长的细胞，有限稀释法，统计克
16、 隆生长百分比贴瓶率测定 贴壁细胞，集落数占接种细胞数的百分 比继传代培养 细胞培养七天收集细胞，计数，去平均 值。连续测试三个周期以上，观察细胞 生长状况。,天然培养基,血清的外观好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。如血清浑浊、不透明、含许多沉淀物，说明血清污染物或血清中的蛋白质变性若血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。,天然培养基,血清的使用与储存使用前处理 灭火处理，即56 30分钟。灭活的目的是去除血清中的补体成分。储存条件 血清一般储存在-20，同时应避免反复冻融。购买大包装的血
17、清后首先要灭活处理，然后分装成小包装，储存于-20，使用前融化。融化时最好先置于4。融化后的血清在4不宜长时间存放，应尽快使用。使用浓度 自从有了合成培养基，血清就是作为一种添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为520%，最常用是10%。,天然培养基,使用血清的优缺点牛血清的优点来源充足制备技术成熟经过长时间的应用考验人们对其比较深入的理解细胞培养中使用血清的缺点改变某种细胞在体内的正常状态含有一些对细胞会产生毒性的物质每批血清都有差别，其成分不能保持一致取材过程有可能带入支原体、病毒,天然培养基,基本培养基如何选择培养基培养基的配制无血清培养无蛋白培养基限定化学成分培养,合成培养基,合
18、成培养基是人工设计、配制的培养基。早期组织培养是利用天然培养基，目前合成培养基已经成为一种标准化的商品，从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基，并且还在不断发展。合成培养基的出现极大促进了组织培养技术的普及发展。,合成培养基,基本培养基基本组分无机盐 CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4氨基酸 缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱（L型）维生素 偏多酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄 素、硫胺素碳水化合物 葡萄糖除了以上与细胞生长有关的物质外，培养基中还要加入一种pH指示剂酚红（当溶液酸性时pH小于6.8呈黄色；当溶液碱
19、性时pH大于8.4呈红色）,合成培养基,基本培养基种类MEM 仅含12种必需氨基酸、谷氨酰胺，8种维生素及必要的无机盐，由于成分简单，易于添加某种特殊成分适于某些特殊细胞培养DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，分高糖型（低于4500g/L）和低糖型（低于1000g/L）高糖性有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难的肿瘤细胞。,合成培养基,基本培养基种类IMDM(Iscoves modified Dulbeccos medium)含有42种成分，与DMEM比较增加了许多非必须氨基酸
20、及一些维生素，增加了HEPES，葡萄糖含量为高糖性。适合细胞密度较低、细胞生长困难的情况，如细胞融合之后杂交细胞的筛选培养，DNA转染后转化细胞的筛选培养。RPMI1640 其组分较为简单，适合许多种细胞生长，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。是目前应用最为广泛的培养基之一。,合成培养基,如何选择培养基 选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考；建立某些细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选RPMI1640；进行细胞杂交、基因转移实验，可选择IMDM。用多种培养基培养目的
21、细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法。,合成培养基,培养基的配置 目前在国内市场主要是干粉型，应正确配置，才能保证培养质量。配制培养基要注意以下问题：认真阅读说明书。说明书都标注干粉不包含的成分，常见的有NaCO3谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，有些是根据实验需要决定的。配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。配制所用的水应是双蒸水或三蒸水，离子浓度很低，三蒸水最佳。所用器皿应严格消毒。配制好的培养基应马上过滤除菌，无菌保存于4。,合成培养基,无血清培养基
22、 无血清培养基即不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养实验的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用。这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者更大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌物。,合成培养基,无血清培养基无血清培养基的基本配方 基础培养及添加组分两大部分。基础培养液以HamF12和DMEM最为常用，一般1：1混合。添加组分包括以下几大类物质：促贴壁物质 贴壁细胞，无血清培养
23、基中一定要添加促贴壁和扩展因子促生长因子及激素 针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。,合成培养基,无血清培养基无血清培养基的基本配方酶抑制剂 培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的，最常用的是大豆胰酶抑制剂。结合蛋白和转运蛋白 转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。微量元素硒是最常见的。,合成培养基,无蛋白培养基（protein fre
24、e medium,PFM）无蛋白培养基即不含有动物蛋白的培养基。无血清培养基仍含有较多的动物蛋白，如胰岛素，转铁蛋白、牛血清白蛋白等。从生物技术发展的趋势来看，不含动物蛋白的培养基有广泛的应用前景，许多利用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体，如果在生长过程中使用了含有动物蛋白质的培养基，纯化过程就比较复杂，最终要达到一定的质量标准也有一定的难度。无蛋白培养基就是为了适应这发展趋势而出现的，许多无蛋白培养基添加了植物水解物以替代动物激素、生长因子的作用。目前已经有适合于CHO细胞生长的PFM。PFM只适合于悬浮生长的细胞。,合成培养基,限定化学成分培养（Chemical defined m
25、edium,CDM）限定化学成分培养基（CDM）是指培养基中的所有成分都是明确的。它不含有动物蛋白，也不添加植物水解物，而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于293细胞、CHO细胞、杂交瘤细胞生长的CDM。CDM只适合于悬浮生长的细胞,合成培养基,其他培养用液,平衡盐溶液消化液pH调整液,其他培养用液,平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS）组成 平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成作用 是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简 单的营养用途 主要用于取材时材料组织块的漂洗、细胞的漂 洗
26、、配置其他试剂 配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有Ca 2+、Mg2+，应当首先溶解这些成分。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。,其他培养用液,消化液用途 取材进行原代培养时需要将组织块消化解离形成细胞悬液传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶颈上消化下来胰酶溶液胰酶的活性可以用消化酪蛋白的能力表示，常见1:125和1:250组织培养用的胰酶溶液一般配制成0.10.25%的浓度，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液胰酶作用及溶解的最佳pH 89，配制胰酶溶液应将液体调至pH8过滤除菌,其他培养用液,消化液EDTA溶液EDTA溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间
27、的连接。对于一些贴壁特别牢的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶，配制后过滤除菌，也可高温消毒灭菌。胶原酶溶液胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为0.10.3mg/L或200000U/L，作用的最佳pH6.5胶原酶不受Ca 2+、Mg2+及血清的抑制，配制时可用PBS.,其他培养用液,pH调整液NaHCO3溶液NaHCO3是培养基中必
28、须添加的成分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保证培养基在5%CO2的环境下pH达到设计标准。如果是封闭式培养，既不与5%CO2的环境发生交换达到平衡，所使用的培养基就不能按照说明书所要求加入NaHCO3。此时常用5.6%或7.4%的NaCO3溶液调节培养基，使之达到所要求的pH环境。HEPES溶液HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）是一种弱酸，对细胞无毒性，主要作用是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。,其他培养用液,抗生素常用
29、的是青霉素和链霉素，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。一般使用青霉素终浓度0.0070.008g/100ml，链霉素终浓度0.01g/100ml 配制成100倍浓缩液，可用PBS或培养基配制。,环境和消毒,无菌室超净工作台三重纯水蒸馏器抽气泵压力蒸汽消毒器电热恒温培养箱CO2培养箱恒温水浴锅倒置显微镜离心机无菌过滤器洗刷装置细胞计数板和电子细胞技术仪,细菌培养中常用的仪器设备,环境和消毒,细胞培养的无菌环境无菌室无菌室的结构 一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。无菌室的消毒和防污染为保持无菌状态，经常消毒是必
30、要的，通常采用每日（使用前紫外照射（12小时），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。应注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间等。,环境和消毒,细胞培养的无菌环境超净工作台工作原理鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空气而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为测流式、直流式和外流式三种类型。,环境和消毒,细胞培养的无菌环境超净工作台超净工作台的使用与保养超净工
31、作台的平均风速保持在0.320.48米/秒为宜，过大、过小均不利于保持净化度。使用前最好开启超净台内紫外灯照射1030分钟，然后让超净台预工作1015分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间成净化状态。使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周檫拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用甲醛熏蒸超净台。,环境和消毒,常用培养皿及清洗消毒 细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等。因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是学习和从事细胞培养工作必须的。,环境和消毒,常用培养皿及清洗消毒玻璃器皿的清洗浸泡 新玻璃器皿使用前的先用自来水简单刷洗，然后用5%盐酸浸 泡过夜；
32、用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后 不易洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。刷洗 将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤水中，用软毛刷反复刷洗。不要 留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器 皿洗净、晾干，备浸酸。浸酸 浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强 氧化作用清除器皿表面可能残留物质。浸酸不应少于六小时一 般过夜或更长。冲洗 刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲 洗干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至要反复“注水-倒空”15次以上，最后用重蒸水浸 洗23次，晾干或烘干后包装备用。,常用培养皿及清洗消毒橡胶制品清
33、洗新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH 煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl 煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水20分钟，50 烤干备用。塑料制品的清洗塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐磨蚀能力强、但不耐热。清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸入自来水中过夜，用纱布或棉签和50清洗刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洗液中15分钟，流水冲洗（1520 遍），蒸馏水浸洗三次，双蒸水中泡24小时，晾干备用。,环境和消毒,环境和消毒,消毒和灭菌紫外线消毒杀菌对象：紫外线可以杀死多种微生物。其中，革兰氏阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。杀菌机
34、制：紫外线是一种低能量的电磁辐射，直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。使用范围：目前多用紫外线直接照射培养室进行消毒，用法简单，效果好。,环境和消毒,消毒和灭菌紫外线消毒使用方法：紫外线的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合离地面2米的30 w灯可照射9平方米房间，每天照射23小时，期间可间隔30分钟。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5米照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米，照射时间30分钟为宜。注意事项：
35、紫外线不仅对皮肤、眼睛伤害，而且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外灯操作。,环境和消毒,消毒和灭菌高温湿热灭菌杀菌机制：压力蒸汽灭菌时常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良 好的穿透能力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。适用范围：布类，衣物玻璃器皿，金属器皿，橡胶和某些培养液都可以 用这方法灭菌。使用方法：不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效 消毒压力和时间不同。一般物品采用压力15lbf/in2(121)，维持1530 分钟，培养液和橡胶类物品采用10lbf/in2(115)，维持10分钟。注意事项：从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立
36、即放到6070烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿 的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，他具有条件简单，使用方便等优点。,环境和消毒,消毒和灭菌高温干热消毒杀菌机制：干热灭菌主要是将电热烤箱物品加热到160以上，并保持 90120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。适用范围：主要用于灭菌玻器皿（如体积大的烧杯、培养瓶）金属器皿 以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。注意事项：干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后再打开，切忌立 即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱物 品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。烧灼也是灭菌方法之一，进行细胞培养，靠须利用台面
37、上的酒精灯的火焰队金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。,环境和消毒,消毒和灭菌过滤除菌杀菌机制：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。适用范围：在体外培养时，过滤除菌大多数用于预热容易变性而失败的试剂或培养液。注意事项：目前，大多数实验室采用微孔滤膜除菌，关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。,环境和消毒,消毒和灭菌化学消毒新洁尔灭（苯扎溴铵），其0.1%水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行檫拭和浸泡消毒。抗生素消毒抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择
38、。,可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁尔灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒液培养基。,环境和消毒,消毒和灭菌可用于细胞培养的灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。消毒实验室空气 过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段。消毒实验室地面 多用新洁儿灭消毒培养用器皿 常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等 方法消毒培养基 采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法,培养物的污染及防止,按现代的观念，凡
39、是混入培养环境中对细胞生存产生有害的成分和造成细胞不纯的异物都应该视为污染，组织培养污染物应包括：生物（真菌、细菌、病毒和支原体）化学物质（影响细胞生存、非细胞所需的化学成分）细胞（非同种的其他细胞）其中以微生物最为多见。另外，随着使用细胞种类增多，不同细胞交叉污染，尤其是Hela细胞的污染也时有发生，从而造成细胞不纯。,培养物的污染及防止,污染途径空气 空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。空气流动性较大，如果培养操作场地与外界隔离不严格或消毒不充分，外界不洁空气很容易进入造成污染。因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行工作时要带口罩，以免讲话、咳嗽等外界污染物进入操作面，
40、造成污染。器材 各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染，另外需要对培养箱进行定期消毒，防止形成污染。,培养物的污染及防止,污染途径操作 实验操作无菌观念不强，技术不熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等。都可以造成污染。培养两种细胞以上时，操作不规范，交叉使用吸管或培养液，瓶等有可能导致细胞交叉污染。血清 有些血清 在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成了污染。组织样本 原代培养的污染多数来源于组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造成点混入组织、细胞或培养液中，影响细胞生长。,培养物的污染及防止,污染对培养细胞的影响及污染的检测 由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的
41、抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。细胞污染早期或污染程度较轻时，如果能及时去除污染物，部分细胞有可能恢复，但是当污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分类象减少，细胞变得粗糙，轮廓增强细胞浆出现颗粒、污染较严重，细胞增值停止，分裂象消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆、脱壁。,培养物的污染及防止,污染对培养细胞的影响及污染的检测细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测常见的污染细菌有大肠杆菌、假单胞菌、葡萄球菌等。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况用倒置显微镜观察不易判断。细菌污染大多数可以改变培养液pH，
42、使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养基背景变的模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效,培养物的污染及防止,污染对培养细胞的影响及污染的检测真菌污染对细胞的影响及污染物的检测微生物污染中以真菌最多，真菌种类繁多，形态各异，但是污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养基表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞之间。念球菌和酵母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之间生长。真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。抗真菌制剂对预防和排除真菌污
43、染有效。,培养物的污染及防止,污染对培养细胞的影响及污染的检测支原体污染对细胞影响及污染物的检测支原体是一种介于细菌和病毒之间、能独立生活的最小微生物，无细胞壁，形态呈椭圆形，最小0.2m，可以通过过滤器。常在购买各种血清中含有支原体。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，影响DNA合成，抑制细胞生长支原体是细胞培养中最常见的、干扰试验结果的一种污染。但由于不易被察觉，有些污染的细胞仍在被应用。对支原体的污染必须严加防范。用可那霉素预防支原体污染有效。,培养物的污染及防止,污染对培养细胞的影响及污染的检测细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的
44、检测细胞培养中，细胞间交叉污染并不罕见，多是由于在培养基中操作时各种细胞同时进行，混杂使用器皿和液体所致，这种污染能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化，有些变化较轻、不易察觉，有些可能由于污染的细胞具有生长优势最终压过原来细胞而导致细胞的生长抑制、最终死亡。常见观察细胞形态学、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等方法检测交叉污染的细胞。,培养物的污染及防止,污染的防治开始操作前的预防定期清洗或更换超净台的空气滤网，定期检查超净台的空气净化标准检查培养皿是否有消毒标志，有条件的实验室可以使用一次性用品检查新配置的培养液，确认无菌后方可使用操作前提前半小时启动超净台的紫外灯消毒操作台应带口罩，
45、消毒双手,培养物的污染及防止,污染的防治防治污染，预防是关键，预防措施应该贯穿整个细胞培养的始终器皿准备中的预防用于细胞培养的器皿应该严格消毒，做到真正洁净应该无菌的物品，要做到消毒严格、真正无菌器皿的运输、贮存过程中要严格操作，谨防污染,培养物的污染及防止,污染的防治操作过程中的预防超净台内放置的所有培养瓶瓶口不能与风向相逆，不允许用手触及器皿的无菌部分，如瓶口和瓶塞内侧。在安装吸管冒、开启或封闭瓶口操作时要经过酒精灯烧灼，并在火焰附近工作。吸取培养液、细胞悬液等液体时，应专管专用，防止污染扩大或造成培养物的交叉污染。使用培养液前，不易较早开启瓶口；开瓶后的培养瓶应保持斜位，避免直立；不再使
46、用的培养液应立即封口。培养的细胞在处理之前不要过早的暴露空气中。操作时不要交谈、咳嗽，以防唾沫和呼出气流引发污染。操作完毕后应将工作台整理好，并消毒檫拭工作面，关闭超净台。,培养物的污染及防止,污染的防治其他的预防及早冻存培养物重要的细胞株传代工作应有两个人独立进行购入的未灭活血清应采取56水浴灭活30分钟，使血清的补体和支原体灭活为了避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统的抗生素，或尽可能不用抗生素对新购入的细胞株应加强观察，防止外来的污染源定期消毒培养箱,培养物的污染及防止,污染的排除培养的细胞一旦污染应及时处理，防止污染其他细胞。通常选高压灭菌被污染的细胞，然后弃掉。如果有价值的细胞被污染
47、，并且污染程度较轻，可以通过及时排除污染物，挽救细胞恢复正常。,培养物的污染及防止,污染的排除常用的排除微生物污染的方法有以下几种：抗生素排除法：各种抗生素性质不同，对微生物作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后应用好；如果发生微生物污染后再使用抗生素，常难以根除。有的抗生素对细菌仅有抑制作用，无杀灭效应。反复使用抗生素还能使微生物产生耐药性，而且对细胞本身也有一定的影响，因此有人主张尽量不用抗生素处理。一些有价值的细胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在这种情况下可采用510倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用2448小时，再接入常规的培养基，有时可以奏效。,培养物的污染及防
48、止,污染的排除加温除菌根据支原体耐热性能差的特点。有人讲受支原体污染的细胞置于41中作用510小时（最长可以达18小时）杀灭支原体。41对细胞本身应有较大的影响，故在处理前，应先进行预实验，确定最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。,培养物的污染及防止,污染的排除动物体内接种 受微生物污染的肿瘤细胞可以接种到同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭微生物，肿瘤细胞却能在体内生长，待一定时间，从体内取出再进行繁殖。,培养物的污染及防止,污染的排除与巨噬细胞共培养在良好的体外培养条件下巨噬细胞可以存活710天，并可以分泌一些细胞因子支持其他细胞的克隆生长。与体内情况相似，巨噬细胞在体外条件下仍然可以吞噬微生物并能够将其消化。利用96孔板将极少培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度的同时，更有效第发挥巨噬细胞清除污染的效能。本方法与抗生素联合应用效果更佳。,
