动物细胞培养基本技术与原理.ppt

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1、第二章动物细胞培养基本技术与原理,细胞与组织培养（体外培养）(cell and tissue culture)：从机体中取出组织或细胞，模拟体内生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。包括三个层面：器官培养、组织培养、细胞培养 分别代表细胞水平、组织水平或器官水平的培养,动物细胞培养的主要领域及意义,动物细胞的培养特性,动物细胞培养的生存条件,主要讲3方面问题：,一、动物细胞培养的主要领域及意义,单克隆抗体与现代医学,动物胚胎孵育与畜牧业,动物细胞培养与现代医药业,动物克隆的广泛应用,1.单克隆抗体技术与现代医学,单克隆抗体技术步骤：*骨髓瘤细胞(myeloma cell)特定抗原免疫刺激的B

2、淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合 杂交瘤细胞(hybridoma cell)。,杂交瘤细胞的特性：*既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology)。,单克隆抗体的特性：*具有高度的特异性、灵敏性与准确性应用：临床医学的疾病诊断。生产各种免疫疫苗。用于某些肿瘤的治疗。用于各种基础医学研究。,2.胚胎孵育与畜牧业,农畜动物胚胎移植：利用胚胎技术大批量生产优质胚胎，从而可以降低胚胎成本，扩大移植胚的来源。体外受精：加快农畜良种化。利用体外受精技术进行核

3、移植、性别控制和基因导入，工厂化生产遗传性状稳定、生产性能优良的家畜。,3.动物细胞规模化培养与现代医药,治疗性抗体,抗体药物,4.动物克隆技术有益应用,动物克隆技术的应用前景：（1）保存优良的动物品种（2）拯救濒临灭绝的珍惜动物（3）利用克隆动物工厂生产蛋白质药物（4）利用克隆技术生产人体器官,二、动物细胞特性,动物细胞在活体内的特性,培养条件下动物细胞生长特性,培养条件下动物细胞生理特性,1.动物细胞在活体内的特性,在活体内，动物细胞:分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有明显的形态学特征。如肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能；神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递

4、刺激；红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动；上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。,增殖分化,活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类：第一类是能保持继续分裂能力的细胞，可以继续不断地分裂，如骨髓干细胞、各类前体细胞；第二类细胞群是永久失去分裂能力的细胞，如各类高度特化的细胞；第三类是静止细胞群，即所谓的G0细胞，在正常情况下，它们不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，则重新进入细胞分裂。如人的肝脏细胞等。第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体培养。,2.培养条件下动物细胞的生长特性,离体培养的动物细胞可分为：贴壁依赖型(anchorage-depend

5、ent)非贴壁依赖型(anchorage-independent)兼性贴壁细胞,1）贴壁依赖型 简称为贴壁细胞，包括成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多形性细胞型。成纤维细胞型 细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞内呈梭形或不规则三角形，中央有园形核，胞质向外伸出23个长短不同的突起。细胞群常连接成网，生长时呈放射状或火焰状。除真正的成纤维细胞外，心肌、平滑肌、成骨细胞培养时均属这一类型。,游走细胞型 在支持物上分散生长，不连接成片，细胞胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走和变形运动，速度快而方向不规则。在一定条件下，可转变为成纤维细胞型。多形性细胞型 某些组织和细胞，如神经细胞，难以确定它

6、们的稳定形态，可统归于多形细胞型。,nerve cell,2）非贴壁依赖型 也称悬浮型，这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中悬浮生长。来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞等均属于此类，细胞一般呈圆形。3）兼性贴壁细胞 动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。,4.培养条件下动物细胞的生理特点,1）动物细胞的分裂周期长 动物细胞分裂周期一般为1248小时，它不仅随细胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不同部位的细胞所需的时间也不同。此外，培养条件如温度、pH、培养基的成分等，也会影响分裂周期的长短。,2）接触抑制(

7、contact inhibition)现象 除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。,3）有限细胞系和永久细胞系 动物细胞离体培养起始物-原代培养（primary culture）经继代培养后即成为有限细胞系(finite cell line)。有限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，一般经过3050世代后细胞将逐渐死亡。,“代”：继代次数和存活

8、时间的长短因细胞来源的年龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。,大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。永久细胞系有如下特征：细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时

9、间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。永久细胞系的建立是动物细胞规模化培养的前体。,4）动物细胞的环境敏感性 动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些，其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。动物相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞存活。动物细胞培养对营养条件的要求也十分复杂。,三、动物细胞的环境要求,1.动物细胞培养的环境要求,1）无污染环境2）温度 昆虫细胞培养温度一般是2528 哺乳动物细胞的培养温度一般是37。总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺乳动物细胞

10、在45下只能存活1小时，但在25条件下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4下数小时后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。液氮冻存。,3）pH 动物细胞培养适宜的pH一般在，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH具有较强的忍耐性。,4）气体环境及溶氧 一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和CO2的平衡。,5）渗透压 动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题：培养基的渗

11、透压维持 细胞体内的渗透压维持 大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。,四、动物细胞培养,基本概念和基本步骤:取材分离和组织消化细胞计数常用培养法细胞的常规检查细胞系与克隆动物细胞的大规模培养细胞的冻存与复苏,一、基本概念（general concept）：细胞培养（cell culture）：将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体内的生长环境条件下，使其在体外环境继续生长增殖的过程。原代（初代）培养：指将机体取出的组织或细胞进行初次培养的过程。原代培养的细胞大约增殖10代左右，称为原代

12、细胞。传代（继代）培养：从原代培养的细胞继续转接培养，称为传代培养。传代培养的细胞称为传代细胞。,二、取材、分离和组织消化(to draw the materials from tissue，separation，digestion)（一）取材获取组织 原则上各种动物组织都可进行体外培养，而实际上幼龄组织（尤其是胚胎组织）比老龄组织容易培养、分化程度低的比分化程度高的容易培养、肿瘤组织比正常组织容易培养。取材前要对所取组织的各种情况进行详细记录；所用器皿用前严格消毒灭菌，取材时严格无菌操作。,取材方法:处死动物 取出组织块，放入小烧杯中 用尖嘴眼科剪刀将组织块剪碎（1mm3），用吸管吸取Han

13、ks液冲下剪刀上的碎块，补加35ml Hanks液，用吸管轻轻吹打；低速离心，弃去上清液，留下组织块。（也可用手术刀片将组织块切碎，优点：对细胞损伤较小，缺点是操作时间长，容易污染）对某些软组织碎组织块，可放入注射器玻璃管中或1mm不锈钢/尼龙网筛挤压分离。,（二）组织消化(tissue digestion)用生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。1、常用消化液适用范围（1）胰蛋白酶：适用于细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾、传代细胞等。（2）胶原酶：适用于纤维组织、上皮组织、癌组织等。（3）其他酶：链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等，根据酶的作用特点及组织成分不同适当选

14、用（4）EDTA：最适于消化传代细胞时，常与胰蛋白酶配合使用。,2、组织消化操作方法(tissue digestion method of operation)（1）胰蛋白酶消化(trypsin digestion)将剪碎的组织块放入有玻璃珠的三角烧瓶中，加入3050倍体积的0.25%胰蛋白酶；37水浴内消化3060min，每510min摇动一次。根据效果可中间更换消化液。（静止10min，吸去2/3上清液，补加新鲜胰蛋白酶）Hanks液漂洗两次，每次23min；800r/min离心5min，弃上清液，加入营养液。如有大块，可用纱网过滤。如消化传代细胞，可与EDTA混用。,（2）胶原酶消化(c

15、ollagenase enzymatic digestion)培养瓶中放入15mm3大小的碎组织块，加5ml 2000 u/ml的胶原酶溶液，使终浓度为200u/ml，pH6.5；36.5水浴2448h，视情况可适当延长，无需摇动。期间可更换酶液一次；见组织块已变软，分散于瓶底时，轻微震荡使散成细胞团或单细胞。小心倒出培养液，瓶底可能附着一些巨噬细胞，借此可将其分开（单独培养或弃之不用）；800r/min离心5min，弃上清液，重悬于BSS液中，再重复离心一次；加入培养液制成细胞悬液，用于接种。,三、细胞计数(cell counting)计数悬浮液中细胞的形态及浓度，以判断消化或稀释程度（亦用

16、于培养液中细胞浓度的检查）染色：在干净的离心管中加入9滴细胞悬液，再加入1滴0.4%台盼蓝，混匀，静置23min；充池：在计数板盖片边缘加入12滴染色的细胞悬液，使之完全充满计数板与盖玻片间的空间（无气泡或溢出）,计数：在显微镜下记录计数板四角四个大方格中的活细胞（不染色细胞）总数。一团细胞按一个细胞计数。压线细胞，数上不数下，数左不数右。计算：细胞悬液浓度（细胞个数/ml）=（4大格细胞总数/4）104稀释倍数注意：如细胞团数超过10%，说明消化不充分。细胞接种浓度：310105/ml,四、常用培养法(general cultivation)（一）组织块培养法(tissue piece cu

17、ltivation)将组织块剪切成小块，直接放入培养瓶中，贴附一段时间后，细胞从组织块长出，最终形成单层细胞。,1、悬滴培养法(drop culture)最简单、最原始的培养法 悬滴培养法缺点：细胞生长空间狭小气体不足，不能持续长时间生长培养基易液化，需要常更新培养基凹玻片折光，不便于观察。,2、旋转管培养法(rotate tube culture)组织块或细胞可交替地接触营养液和空气，利于细胞生长；培养管缓慢转动，使整个管内壁全部长满细胞，提高了细胞产量，适于较大量的组织培养和各种长期传代细胞的培养。缺点：不易在显微镜下观察。3、灌注小室培养法(dabble booth cultivatio

18、n)为大规模培养系统提供了参考原理。,4、卡氏瓶培养法 卡氏瓶(carlsbergs flask)（如下图）：将组织块剪碎，BSS漂洗。转移到另一只培养皿，在解剖显微镜下去掉不需要的组织如脂肪、坏死组织等。将组织块切成1mm3小块。用预先润湿的滴管转移到消毒离心管，静置使组织小块下沉，吸去上清。以新鲜BSS漂洗。重复23次。,转移到培养瓶（每个25ml的培养瓶可放置2030块组织小块），吸去液体。加入1ml生长培养液，轻斜摆动培养皿，使组织小块均匀分布。盖好瓶盖，36.5培养1824h。待组织块粘附瓶壁后35天，加入5ml培养液；然后每周更新培养液一次。培养35周，细胞不断增长，肉眼或低倍镜下

19、观察可见围绕组织周围生长犹如日晕，称“生长晕”。取出中央组织块，用预先湿润的滴管移到另一新的培养瓶。重复操作。在原生长晕培养瓶内换入新鲜培养液。待生长晕细胞扩展至约50%培养瓶底表面时，进行细胞培养。,（二）单层细胞培养法(monolayer method)组织块经胰酶消化分散成较小的细胞团或单个细胞，在合成培养液中附在瓶壁上长成单层，即形成所谓单层细胞培养。1、原代培养(primary culture)（初代培养）,2、传代培养(serial subcultivation):传代的理想时期：对数生长期，细胞8090%或刚刚全部汇合。方法：消化：加入胰蛋白酶或胰蛋白酶与EDTA混合液，盖满瓶底

20、，作用25min；检查：如细胞间隙变大，细胞质回缩，则终止消化。终止消化：吸出消化液；加入Hanks液，轻轻转动，洗去残留的消化液。如单用胰蛋白酶，可直接加入培养液。细胞计数：用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落，制成悬液，计数并记录其浓度；重新稀释接种培养。,根据细胞特点，掌握细胞消化时间和选择消化方法。,（三）组织块单层细胞培养法(tissue monolayer method)把组织剪成更小的小块（0.51mm3），由于其体积很小，无需任何粘着剂即能直接附于瓶壁上。细胞自组织块边缘向外长出，最后连接成片，形成单层细胞。优点：简化了原代单层细胞的培养过程。是当前各培养室常用的原代培养法。,方法：

21、取一定量组织置于小烧杯中，先用BSS漂洗23次去掉血污，然后反复剪成0.51mm3的小块。加入12ml培养液，用吸管轻轻吹打，使组织块悬浮。移入培养瓶，并在瓶壁上吹匀。翻转，使有组织块的瓶壁朝上，加入培养液，塞紧瓶口，置37温箱培养12h；待组织牢固贴于瓶壁，再轻轻翻转，使培养液浸泡组织小块，静止培养。为促进细胞贴壁，也可先在瓶内壁涂一层血清。,（四）悬浮细胞培养法(suspended cell culture)利用旋转、振摇或搅拌的方法不让细胞贴壁，使其在培养液中呈悬浮状态生长。适用细胞：淋巴细胞、肿瘤细胞、传代细胞系 培养基：合成培养基 510%血清 0.1%甲基纤维素 培养细胞密度：57

22、105cell/ml.特点：细胞增殖快，产量高，培养过程简单，是动物细胞大规模培养的理想模式。,（五）微载体培养法(microcarrier culture)载体：DEAE-交联葡聚糖微粒、DEAE-纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、无机玻璃基质微载体等微载体培养系统培养细胞步骤：1、选择合适的微载体类型获得最大量的细胞，以微载体能全部悬浮在培养液内为最好2、浸泡水化及消毒 用无Ca2+、Mg2+离子的磷酸缓冲液浸泡3h以上3、接种（根据细胞类型决定接种浓度）4、培养观察与细胞计数5、消化6、分离细胞或传代培养,（六）多孔载体培养(porosity carrier culture)优点：增加细胞固

23、定化稳定性，比表面积大，保证细胞充分的生长空间，细胞生长在载体内部，免受机械损伤。多孔载体被证明是用于大规模高密度细胞培养的优秀细胞生长支持物，具有逐步取代传统的实心微载体的趋势。（七）中空纤维细胞培养法(hollow fiber cell culture)模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的“毛细血管”中空纤维来供给细胞生长的营养等条件细胞向三维空间生长繁殖，形成类似组织的多层细胞群体，细胞密度可达109个/ml。适用于细胞代谢产物和分泌物的生产。,五、细胞系与克隆株（cell line and clone）1、细胞系的建立 原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂，培养初期，生长的细胞

24、类型多种多样随培养时间延长：一些细胞退化、死亡；另一些细胞适应环境而生长繁殖培养物逐步变均匀。传代培养意义：不仅在于维持细胞不断地生长，而且使培养物逐步演变为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，即细胞系。细胞系：*指从原代培养物经传代培养后得来的一群特征专一、类型均匀的细胞，可以长期连续传代。,（1）限定细胞系（有限细胞系）寿命有限，一般为2080代（2）连续培养细胞系（无限细胞系）细胞发生转化，可连续培养和生长，寿命变为“无限”2、克隆株（细胞株）分离单一细胞并使其繁殖形成的细胞群称为细胞株。单个细胞的生活能力很弱，必须采取特殊的培养措施适应和同化过程：在细胞接种到新培养液的初期，细

25、胞既从培养液中摄取营养，也要向培养液排出一定物质，其结果使得培养液更易被吸收和利用。,适应培养液制备：选择生长状态良好的对数生长期细胞，无死细胞和碎片，所用细胞的种类应与要克隆的细胞相同。吸出培养液，用G6滤器过滤贮于冰箱中备用。制备适应性培养基时注意：选用成分齐全的合成培养基，可不加抗生素。,细胞株的制备方法（3种）：（1）集落形成分离法 平皿中接种稀释细胞细胞贴壁繁殖成许多小群选择一个最好的细胞群做标记机械法刮除所有其他细胞群培养保留下来的细胞群.,克隆成功的关键：接种细胞数量要合适、细胞要分散得好。太多则使细胞操作不便，以每个平皿50100个细胞为宜。选择细胞克隆时，应逐日观察，能证明被

26、选留的细胞群确系来自于单个细胞。刮除和洗涤一定要彻底。,（2）琼脂分离法（agar Separation）琼脂培养基的制备：选择质量好的琼脂，用三蒸水配成3%的溶液，分装，灭菌。培养方法：向琼脂平皿中接种稀释细胞悬液（适应培养基），培养后，标记出保留细胞，在显微镜下切下保留细胞处琼脂小块，在BSS中轻轻漂洗后，用适应培养基继续培养。,（3）多孔塑料板分离法（foamed plastics Separation）将1ml含有78个细胞的悬液接种到多孔无毒塑料板中，每一块板上有数十个圆形小穴。选择仅有单个细胞的小孔观察，待单细胞繁殖成克隆充满小孔后，用胰酶消化分离细胞，转移至培养瓶中继续培养。,六

27、、细胞的常规检查（corpuscular routine examination）检查内容：细胞的生长状态、培养液pH、污染、细胞活力。1、细胞生长潜伏期：不同组织和细胞潜伏期不同。胚胎组织次日可见生长，1周内即连接成片。老年组织、癌组织潜伏期长。游离期细胞呈悬浮状态。细胞质回缩，胞体呈圆形。吸附期：与细胞种类、培养环境有关。大多数在24h内贴壁。细胞机能状态不良或濒死细胞不贴壁培养基偏酸或偏碱、污染、胶基有毒、培养瓶洗刷不洁等均不利于细胞贴壁。支持物表面带正电荷利于贴壁。,繁殖期（idiophase）细胞由圆形变成延展细胞，进而过渡成极性细胞；继之出现细胞分裂，细胞数目不断增多；同时有一定的

28、移动现象。退化期（catagen）细胞长满瓶壁后，如不及时做再培养，由于营养物消耗和代谢物积累，细胞变得粗糙（轮廓分明、胞内颗粒状物堆积），严重时甚至从瓶壁脱落。,2、细胞形态（cellular shape）生长良好细胞：倒置显微镜下观察透明度大，轮廓不清。机能不良细胞：轮廓鲜明，胞质中常出现空泡、脂滴和其他颗粒状物；细胞形态不规则，失去原有特点；细胞间隙加大。3、培养液pH正常情况下，培养液呈桃红色。随细胞生长时间延长，CO2积累增多，超出缓冲范围后酸化变黄，须及时更换。,4、微生物污染(microbial contamination)常见来源：培养液、培养塞、血清、操作时空气污染。常见病菌

29、：霉菌、细菌、支原体。霉菌：培养基中出现相应的菌落。细菌：培养液混浊，镜下可见大量细菌；如怀疑污染而培养液无明显改变时，可将培养物进行细菌培养以验证。支原体污染：经常发生而难以发现。污染后的细胞仍能生存，甚至无明显变化；有时可发生不同程度的病理改变。预防方法：严格遵守无菌操作。并针对不同污染采取相应措施。,5、细胞活性(cytoactive)原理：细胞对色素的吸附性方法：常用的是染色排除法，即死细胞着色法台盼蓝染色：0.4g台盼蓝，溶于100ml Hanks液，调pH至7.07.2。按细胞悬液：染液=9：1比例混合，4min后计数。注意时间过长，活细胞亦可受损而着色。,苯胺黑染色：0.05%苯

30、胺黑（溶于Hanks液）同上比例染色，稍放置后镜检。注意苯胺黑溶解性较差，用前应先过滤。藻红B染色：0.02%藻红B（溶于Hanks液）染色，2h内镜检。注意藻红B易同蛋白质结合，须把血清洗净。另：活细胞着色法 结晶紫染色：0.1%结晶紫（溶于Hanks液）染色，混合后立即镜检。,七、动物细胞的大规模培养（zooblast mass culture）培养方式 反应物 营养液 评价 分批式培养 一次性取出 一次性加入 后期细胞生长不良 根据细胞生长 流加式培养 一次性取出 情况及时补充 细胞生长环境平稳 反馈控制流加 无反馈控制流加经一段时间分 取出反应物同时 适用于微载体 半连续培养 批式培养，取 补充等量新的营 培养系统 出部分反应物 养液 保持细胞优化状态，有利于细胞、产物 连续培养 不断地取出 不断地加入 的连续生产和细胞（灌注培养）生理、代谢规律的研究,八、细胞的冻存与复苏技术(cell freeze resuscitation technique)1、细胞的冻存*细胞系和细胞株的保存：超低温冰箱、液氮罐冷冻保护剂的作用：结合细胞中水分子，降温时减少细胞内冰晶分子的形成，以免对细胞造成伤害。常用冷冻保护剂：DMSO、甘油。*2、细胞的复苏：慢冻快融，迅速投入37水浴中,