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1、第四章 载体,vector,主要内容,载体的概念载体的分类质粒载体噬菌体载体单链丝状噬菌体载体,一载体的概念：1.要把一个有用的基因（目的基因研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具），将外源DNA或者基因携带进入宿主细胞的工具。2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector。基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。,载体应具备的条件,（1）在宿主细胞内能够进行自我复制，具备复制原点。（2）有合适的限制性内切酶位点，每种位点最好有且只有1 个，供外源DNA的插入且不影响其
2、复制；（3）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验，便于筛选；（4）有一定容量且有较高的拷贝数，易于制备。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,载体,二、载体的分类,克隆载体（cloning vector）都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。表达载体（Expression vector）具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。为了有效的转录，必需有强大的能够被宿主细胞识别的启动子，为了实现翻译，克隆基因必需有合适的SD和RbS。具有表达和
3、调控能力的载体称表达载体。,三、质粒载体,1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。,（一）质粒的生物学特性,3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制。4、质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。,5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应
4、该是松弛型的。6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。,（二）标记基因按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。选择标记基因用于鉴别目标 DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。筛选标记基因可用于将特殊表型的重组子挑选出来。筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。,选择标记基因(1)氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene）(2)四环素抗性基因（Tetracycline resistan
5、ce gene）(3)氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene）(4)卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene）(5)琥珀突变抑制基因 supF(6）其它还有一些正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活,r,r,2 筛选标记基因(1)-互补（-complementation）又称蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验）-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶（-galactosidase，由 1024 个
6、氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。,Z Y X,P,O,Z Y X,P,O,乳糖,标志补救（-半乳糖苷酶法）,lacZ,()插入失活 对于双抗性标记的质粒，当外源片段插入任何一个抗性基因中都会造成该抗性的丧失，从而筛选出重组子,pBR322质粒载体,Tetr,Ampr,Ori,pBR322质粒载体,抗药性标志的选择,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,（三）质粒载体的种类 发展阶段：第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传
7、标记基因。如pUC系列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,3.1 克隆载体 用于扩增或保存DNA片段是最简单的载体.如：pBR322质粒载体 符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。,pUC18,pUC19,含四个部分：（1）来自pBR322的质粒复制起点（ori）；（2）ampr;（3）大肠杆菌半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列；（4）多克隆位点（MCS）,lacZ
8、,Ori,Ampr,MCS,能在体外转录克隆基因的质粒载体,3.2 表达载体该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。,1.噬菌体的分子生物学,（四）噬菌体载体,噬菌体基因大致分为4个区：结构区A J19个基因，编码头、尾部蛋白质为结构区,重组区 att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），调控区启动子、终止子和NuI基因，O-R 为裂解区.,1.1 噬菌体发育调节 吸附 立即早期转录 延迟早期转录 溶源和裂解的感染分化 进入裂解生长 溶源化 1.2 噬菌体的可取代区 J 基因与 C
9、ro 基因之间的 DNA 被 ga1 基因或 bio 基因替换后，不影响 噬菌体裂解生长。这个区段约占噬菌体 DNA 的 1/3，主要包含控制噬菌体进入溶源状态的调节基因和功能基因,2.噬菌体载体的选择标记 2.1 基因组大小 重组噬菌体的基因组 DNA 太大或太小会影响其存活能力。外源 DNA 片段的大小将在 9-23kb 范围内 2.2 lacZ 基因 lacZ 基因也可用于 噬菌体载体，通过插入或替换载体中的-半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体 2.3 基因 c 失活 基因 c 是 噬菌体的抑制基因，全面抑制并阻断基因的表达.如果外源
10、DNA 片段插入基因 c 中，将高频率地使 E.coli 进入裂解生长状态。2.4 Spi 筛选 通过噬菌体载体 DNA 上的 red 和/或 gam 基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体。,3.代表性噬菌体载体3.1 插入型载体 通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体称为插入型载体。由于 噬菌体对所包装的 DNA 有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入 6kb 外源 DNA 片段，最大 11kb。,gt10载体,大小为 43340bp，是经典的 噬菌体载体，主要用作 cDNA 克隆，允许的插入片段大小为 0-6kb。,gt11 载体 大小为
11、 43.7kb，是一个常用的载体。gt11 载体允许插入的 DNA 片段大小为 07.2kb。它用于构建 cDNA 文库、基因组文库和表达融合蛋白。,该载体最大的特点是在最左侧可替代区置换了一段 lac5 基因，可编码-半乳糖苷酶，在 IPTG/X-gal 平板上形成兰色噬菌斑。lac5 基因编码区终止密码子之前有一个 EcoR 位点（53bp 上游），可用于外源 DNA 片段的插入。筛选时，在 lac-宿主菌中非重组噬菌斑为兰色。当外源 DNA 片段与 lacZ 的阅读框相吻合时，可表达出融合蛋白，可用免疫学方法筛选阳性重组子。,GEM-2/4 GEM-2 和 GEM-4都是由 gt10 改
12、造而来，也是 cDNA 克隆ZAPZAP 整体上与 gt11 相似，不同的是在基因 J 和 att 位点之间用 pBluescript SK 质粒片段取代了相应的 噬菌体片段，允许插入 0-10kb 的外源片段。因此，该载体具备了 pBluescript SK 质粒的一些特性，如-互补以及可通过启动子合成 RNA 探针。ExcellExcell 大小为 45.5kb，与 ZAP 相似。不同的是，在该载体中装载了 pExCell 质粒载体片段（4190bp）。该载体允许外源 DNA 插入的大小为 0-6kb，主要用于 cDNA 克隆。pExCell 与 pBluescript 载体相似，除了多克
13、隆位点不同外，插入了一段来自 噬菌体的片段。该片段含有 噬菌体整合到大肠杆菌染色体所必须的整合位点 att。,3.2 置换型载体 允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb，故而该载体主要用来构建基因组文库。,EMBL3 和 EMBL4 这两个载体大小为 43kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为 20kb、9kb 和 14kb。从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段的大小为 9-23kb。在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段
14、后，重组体将变成 red-gam-，同时载体上含有 chiC 位点，因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体,2001、DASH 和 FIX 载体 2001、DASH 和 FIX 载体的结构和大小与 EMBL3 载体相似，主要不同在于多克隆位点的酶切位点数量、排列和种类不同。DASH 和 FIX 载体的特点在于，在其多克隆位点中含有 T7 噬菌体启动子和 T3 噬菌体的启动子。这些噬菌体的启动子可在体外转录合成RNA，用作染色体步查（chromosome walking）的探针。,GEM-11 载体 GEM-11 载体的左右臂来自 EMBL3 载体，填充片段来自 2001
15、，是一个多功能置换载体。其多克隆位点与上述置换载体稍有不同，但保留 Xho 位点，同时在填充片段的最末端各有一个识别 8 个核苷酸序列的稀有酶切位点 Sfi。在获得阳性克隆后，通过 Sfi 酶切位点可将外源片段从载体中切割下来进行亚克隆，而在相当大程度上不会切割外源片段。还有一个区别是，在右边的多克隆位点中有 SP6 噬菌体的启动子，而不是 T3 噬菌体的启动子,4.噬菌体载体的克隆原理及步骤 主要用于克隆DNA片段，构建cDNA文库和基因组文库并丛中筛选目的基因。原理同质粒载体，只是相对分子量太大不能通过转化法直接进入大肠杆菌，要通过包装DNA形成噬菌体颗粒注射到宿主菌中。步骤；通过裂解增殖
16、载体 载体与外源DNA的酶切外源DNA与载体连接重组噬菌体的体外包装包装噬菌体颗粒的感染 筛选,噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导:分离得到某些噬菌体，在低温时（30）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解。这些噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1ts。cl ts1857，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在cl ts857下游，重组体的目的基因在42表达，30不表达。这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关。,CIts857,ori,目的基因,PL,阻遏蛋白,30下培养：,目的基因,阻遏蛋白,42下培养：,失活,PL和 PR,PL和PR
17、 是噬菌体上2个主要的启动子，都是启动能力相当强的转录构件。把启动子连同其附属成分，置换了pBR322的tetr基因，成为以启动子为组件的质粒。,（1）粘粒（cosmid）能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb 6kb）载体。组成：质粒复制原点，抗药基因，多克隆位点，已连接入的cos位点。,构建基因文库的载体,（2）DNA的体外包装 是提高噬菌体转染效率的有效方法 在A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（是包装蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNA转入头部。,（五）单链丝状噬菌体载体,方便的制备单链DNA，用于定点诱变、DNA核苷酸序列测定和制备单链DNA探针。,1.M13噬菌体的
18、生物学1.1 组成和结构 M13 噬菌体的基因组为单链 DNA，由 6407 的碱基组成。基因组 90%以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基 M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因，和），形态发生蛋白（基因，和），结构蛋白（基因、和）。所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组 DNA 为正链，按基因 至基因 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。,1.2 M13 噬菌体的增殖吸附感染复制组装.M13噬菌体载体 单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DN
19、A。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。2.1 载体的插入位点 在 M13 噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源 DNA（基因/和基因/之间）。基因 和基因 之间的 508bp 间隔区是主要的外源片段插入位点。在基因 和基因 之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。基因 也可用来克隆外源片段,2.2 M13 噬菌体载体组成 现在所使用的 M13 噬菌体载体是 Messing 及其同事建立的 mp 系列载体，以基因 和基因 之间
20、的区域作为外源 DNA 插入区。mp 载体系列都是从同一个重组 M13 噬菌体（M13mpl）改造而来的。在 M13mpl 载体中，间隔区内的 Hae 位点插入了一小段大肠杆菌 DNA，引入 互补筛选。2.3M13mpl8 和 M13mpl9这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段。两种载体只是在 lacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。,M13噬菌体载体的宿主菌由于 M13 噬菌体通过 F 质粒编码的性纤毛进入宿主细胞内，故只能用雄性细菌来增殖病毒。Messing 及其同事已经构建了许多携带 F 质粒并便于 M13 载体进行基因操
21、作的多种大肠杆菌菌株。,丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题 外源DNA区段的部分丢失 外源DNA总是以单方向插入,噬菌粒 一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有 ColE1 复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区。pUC118和pUCll9是一对分别由pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体的基因间隔区（IG）重组而成的噬菌粒载体。除了多克隆位点区的序列取向彼此相反而外，两者的分子结构完全一样。,噬菌粒的特征,双链 DNA 既稳定，又高产，具有常规质粒的特征；免去了将外源 DNA 片段从质粒亚克隆于噬
22、菌体载体这一既繁琐又费时的步骤；由于载体足够小，故可得到长达 10kb 的外源 DNA 区段的单链。噬菌粒的主要优点在于它可以产生大段外源 DNA 的适量单链拷贝，又不必担心发生缺失突变，而这些外源 DNA 区段常常由于太大而不能克隆于常规 M13 载体。但许多噬菌粒都有一个主要缺点，即辅助噬菌体感染后，有时候单链 DNA 的产量较低且重复性较差。,6M13KO7 辅助噬菌体M13KO7 辅助噬菌体是 M13 的衍生株，大小为 8.7kb。M13K07 中突变的基因 产物与自身携带的噬菌体复制起点的作用尚不如它与克隆于噬菌粒 pUCll8 和 pUCll9 中的病毒复制起点的作用有效，这就使噬
23、菌粒正链 DNA 能够优先合成，以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌粒的单链 DNA 能够占据优势,载体的元件及性质 克隆载体 ori Amp Mcs E.coli表达载体元件 P Rbs/SDs Mcs terms 真核表达元件 P/E Mcs terms 加poly（A）信号,（三）元件的类别和质量：基因工程前考虑的4个问题：(1)基因工程的目的 克隆扩增/表达:生产产品 基因治疗(2)克隆片段的大小运载多大重量的车子。(3)受体细胞类型 真核/原核/穿梭。(4)载体本身及其元件的质量 不能搞成“豆腐渣工程”，如P要“强大阵容”。,1.Ori复制起始点（origin，ori）（1）决定质
24、粒自我增殖和拷贝数的主要元件。（2）使繁殖后细胞维持一定量的拷贝数。（3）一般情况下，一个质粒只含一个ori，构成一个独立的复制子。（4）穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。（5）基因工程使用松弛复制子，以获得更多的基因产品。复制子 是一段包括复制起始位点，反式因子作用在内的DNA片段，其功能是通过复制使质粒能稳定存在宿主菌内（如E.coli）。松弛复制子的特点 拷贝数多，10200个，分子量小。复制不受宿主细菌复制系统的限制，仅需DDDPI，当宿主蛋白 质合成受到抑制（如培养中加入氯霉素时）其拷贝数猛增至 10003000之多，该性质多基因工程技术十分有利。分子量小
25、，不具备自传递能力。基因工程使用松弛型质粒，如含PBMI复制起点的质粒。,2.抗生素抗性基因：（genotype）编码产物 功能（phenotype）（1）Ampr 酶 水解内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr 1个膜蛋白 可以阻止四环素进入细胞。（3）camr 乙酰转乙酶 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之 失去毒性。（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 潮霉素磷酸转移酶 使潮霉素失活。,3.MCS多克隆位点（multiple cloining site，MCS）（1）MCS 是多个限制酶识别的一段DNA顺序，以便克隆/插入外源基因/D
26、NA片段，与之相关概念有：（2）多聚接头（polyliker）有些质粒载体单一切点少，不能普遍使用。为了扩大使用范围，可以加一段有许多限制酶识别的单一切点的多聚接头。（3）人工接头（linker）是用若干个bp组成的dsDNA片段，一般有一个或以上限制酶识别与切割的顺序。(2)与（3）已经商品化，注意liker与adaptor的区别（下述）,4，启动子（pormoter）（1）概念：促进DNA转录的DNA顺序，又称启动基因或启动序列。这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游（upstream），RNApol结合在上面，指导酶朝向正确的转录位置。启动子又称启动基因，是DNA分子上可以与RNA
27、pol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。DNA分子一个与启动子基因转录有关的区域，包括RNApol识别，结合和转录起始3个功能部位。,（2）原核生物启动子和真核生物启动子的比较,启动子功能性质：决定转录方向，启动启动下游（downstream）基因互补链转录，转录mRNA与信息链一致。决定dsDNA的哪一条链作为模板，转录出RNA。决定转录效率，强启动子转录效率强，弱次之。启动子是可以接受调控的，可以被改造的。,（3）基因工程中常使用强启动子,用于原核表达系统的强启动子LacLacuv5TrpTacPLT7,5.增强子/沉默子（enhancer，E/silencer（neg
28、atire enhancer）（1）概念 为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子负增强子，负调控序列。（2）增强子的作用特点 可在基因的5或3端发挥作用，一般在5端转录起始点上游100至300bp处。不受序列方向制约；通过增强启动子发挥作用。（3）增强子的作用机制：改变DNA的螺旋结构，使其成柔曲线拉近E/P距离；为DNA模板提供某一特定空间微环境促进top异构酶改变DNA双螺旋结构；为RNA pol和反式作用因子提供一个与顺式元件联系的结构。如增强子的荃环利于与反式因子结
29、合。,6.核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列（位于AUG上游311bp处由39bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16sRNA富含嘧啶的序列互补，是RNA识别和结合的位点。由于J.shineL Dagarne（1974）首先发现，故名。mRNA 5-AGGAGGUUGACCUAUG-3-AUCCUCCUAG,-rRNA的3末端（1）翻译水平的调控是不严格的，只有mRNA/Rbs结合才是蛋白质合成的关键。（Rbs是E.coli表达载体必不可少的元件）。（2）不同的启动子表达一种pr.时，
30、SDAUG之间的距离可能是不一样的，在试图提高表达效率，SDAUG之间的距离是重视的因素之一。,7转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子（terminator o transcrition，term terminator of translation,terminator codon,stop codon）：（1）转录终止子/term 指一个基因编码区down stream的DNA顺序，可被RNA pol识别为停止合成mRNA的信号。原核生物中，在转录部分末端term常有一个IR和紧接着的一小段，基因转录部分之外可能还有影响转录终止的顺序。值得注意的是：有些载体不含终止序列，表达外源蛋白质时也
31、可获得较满意的结果（基因转录之外顺序可影响转录终止）；多数外源蛋白质表达载体带有合适的终止顺序；转录终止顺序有长有短，短的长约700800bp。（2）翻译终止密码子/terminator codon mRNA种三个核苷酸顺序可终止蛋白质的合成，有3种终止码：UAA（赫石型）UAG（琥珀型）和UAG（空白型）（参nonsense mutation supperessor。）,8加poly（A）尾信号 结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点downstream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。mRNA转录到此后，产生AAUAAA和随后的GU或U丰富区，与RNApol结合的延长因子，可以识别这种结构并与之结合，然后在AAUAAA下游1030bp的部位切断RNA，并加上poly（A）尾。关于7和8，至今，对真核转录终止信号/终止机制了解不多,主要困难是难以确定原初转录物的3末端，因为大多数基因转录后很快进行加工。现在基因工程表达载体使用的转录终止子都是病毒基因或细胞基因3端的一段序列，其中包括3不翻译区，终止位点和poly(A)位点（整段照搬）。,
