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1、色谱法（层析法）,一、实验目的,1、了解色谱法分离、提纯有机化合物的基本原理和应用。2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。,二、实验原理,色谱法（Chromatography）亦称色层法、层析法等。色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。,色谱法须在两相系统间进行。一相是固定相，需支持物，是固体或液体。另一相为流动相，是液体或气体。当流动相流经固定相时，被分离物质在两相间的分配，由平衡状态到失去平衡到又恢复平衡，即不断经历
2、吸附和解吸的过程。随着流动相不断向前流动，被分离物质间出现向前移动的速率差异，由开始的单一区带逐渐分离出许多区带，这个过程叫展层。,分类,按层析的机理划分：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。,按流动相与固定相的不同划分：气相色谱（层析）、液相色谱（层析）。这两大类层析是以流动相不同来划分的。如同时区分流动相和固定相，划分为
3、：气固层析、气液层析、液固层析和液液层析等。,按操作形式划分：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析，纸层析是一种分配层析，柱层析可做各种层析。,吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂，将一些物质自溶液中吸附到它的表面上，而后用溶剂洗脱或展开，利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用，和它们在溶剂中不同的溶解度，也就
4、是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之间分布情况的不同而得到分离。吸附色谱分离可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。,（一）柱层析法,1.原理,流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动，吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动，在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配，新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程，结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现混合物的分离。,2.柱色谱分离条件 固定相选择柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂。吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。以氧化
5、铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱；极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为：成盐作用 配位作用 氢键作用 偶极作用 范德华力作用。有机物的极性越强，在氧化铝上的吸附越强。,表1：各种吸附剂对于极性有机物的吸附作用强度,常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等（表1）。,纤维素、淀粉硅酸镁硫酸钙硅胶弗罗里硅土氧化镁中性氧化铝活性炭,对极性有机物的吸附作用增强,色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝pH约为4-4.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5，用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化
6、铝pH为9-10，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低，活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。硅胶是中性的吸附剂，可用于分离各种有机物，是应用最为广泛的固定相材料之一。活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。吸附剂的粒度越小，比表面越大，分离效果越明显，但流动相流过越慢，有时会产生分离带的再重叠，适得其反。,流动相选择色谱分离使用的流动相又称展开剂。展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重要的影响。,在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附-溶解分配，强极性展开剂对极性大的有机物溶解的多，弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多，随
7、展开剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。在氧化铝柱中，选择适当极性的展开剂能使各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离带，流出色谱柱。,表2：各种展开剂对极性有机物的溶解能力,石油醚环己烷四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮吡啶乙醇甲醇水乙酸,对极性有机物的溶解作用增强,当一种溶剂不能实现很好的分离时，选择使用不同极性的溶剂分级洗脱。如一种溶剂作为展开剂只洗脱了混合物中一种化合物，对其它组分不能展开洗脱，需换一种极性更大的溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的展开剂可以将各组分分离。,薄层层析又叫薄板色谱，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱，它兼备了柱色谱和
8、纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。,（二）薄层层析法,1.原理：吸附剂被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂层。干燥后在涂层的一端点样，放入一个盛有少量展开剂的的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向上移动。经过在吸附剂和展开剂之间的多次吸附-溶解作用，将混合物中各组分分离成孤立的样点，实现混合物的分离。,2.色谱条件,固定相选择 柱色谱中提到的吸附剂
9、都可以用作为薄层色谱的固定相，分离性能及使用选择同柱色谱的选择原则相同（各种吸附剂见柱色谱表1）。一般用于薄层色谱时，要求吸附剂的粒度更小。商品吸附剂区分为色谱级（用于柱色谱）和薄层色谱级（用于薄层色谱）。,展开剂选择薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，主要根据样品中各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解度等因素来考虑。展开剂的极性越大，对化合物的洗脱力也越大。（各种溶剂极性见柱色谱表2）。,选择展开剂时，除参照表列溶剂极性来选择外，更多地采用试验的方法，在一块薄层板上进行试验：若所选展开剂使混合物中所有的组分点都移到了溶剂前沿，此溶剂的极性过强；若所选展开剂几乎不能使混合物中的组分点移动，留在
10、了原点上，此溶剂的极性过弱。当一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物，若展开不好，用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，再次试验，直到选出合适的展开剂组合。合适的混合展开剂常需多次仔细选择才能确定。,相对移动值 从点样原点开始到展开后的溶剂前沿，是溶剂的移动距离，记为l0，混合物中各组分的移动距离分别记为l1，l2，l3（移动值示意图）。,比移值示意图,在不同的展开条件下，各化合物的移动距离不会相同，而在同一条件下，相对于展开剂的移动距离，各化合物有可比较的展开数据，称为相对移动值，或比移值：Rf=l1/l0在相同条件下测得的
11、比移值可以作为化合物的薄层色谱特征值进行比较对照。,l0,l1,l2,显色 分离的化合物若有颜色，很容易识别出来各个样点。但多数情况下化合物没有颜色，要识别样点，必须使样点显色。通用的显色方法有碘蒸气显色和紫外线显色。碘蒸气显色：将展开的薄层板挥发干展开剂后，放在盛有碘晶体的封闭容器中，升华产生的碘蒸气能与有机物分子形成有色的缔合物，完成显色。紫外线显色：用掺有荧光剂的固定相材料（如硅胶F，氧化铝F等）制板，展开后在用紫外线照射展开的干燥薄层板，板上的有机物会吸收紫外线，在板上出现相应的色点，可以被观察到。有时对于特殊有机物使用专用的显色剂显色。此时常用盛有显色剂溶液的喷雾器喷板显色。,3.薄
12、层色谱应用,可用于判断两个化合物是否相同（同一展开条件下是否有相同的移动值）；可用于确定混合物中含有的组分数；可用于为柱色谱选择合适的展开剂，监视柱色谱分离状况和效果；可用于检测反应过程。,三、基本操作,正确装柱、制板、点样及分离操作,薄层板在不同的层析缸中展开的方式,1、装柱用镊子取少许脱脂棉放于干净的色谱柱底部，轻轻塞紧，关闭活塞，通过一干燥的玻璃漏斗向柱中慢慢加入色谱柱用中性氧化铝10g，并用橡皮塞轻轻敲打色谱柱下部，使填装紧密，在上面加一片小圆滤纸或脱脂棉使表面水平。用滴管沿管壁加入酒精，使酒精顺柱体向下展开，打开活塞，控制流出速度为1滴/秒。,【柱色谱操作步骤】,2、进样 待酒精全部
13、浸润氧化铝，液面刚好流至滤纸面时，立即用滴管从层析柱管中心加入待分离样品溶液，当此溶液流至接近滤纸面时，立即用少量溶剂洗下管壁的有色物质，如此连续23次，直至洗净为止。3、洗脱 依次用酒精和NaOH洗脱，控制流出速度。整个过程都应有洗脱剂覆盖吸附剂。（每一种试剂加入前，前一种都要刚刚浸过滤纸片）,【薄层色谱操作步骤】,1、薄层板的制备（湿板的制备）薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。薄层应尽量均匀且厚度要固定。否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。在烧杯中放入2g硅胶，加入56ml蒸馏水，调成糊状。将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下
14、晾干后进行活化。也可买市售的硅胶板切割成适宜大小备用。本实验用此法制备薄层板：吸附剂为硅胶G，用0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液调成浆料。,2、点样 先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，吹干。斑点直径一般不超过2mm。若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。若在同一板上点几个样，样点间距离应为0.5-1cm，且不能离边沿太近。点样要轻，不可刺破薄层。当展开剂到达距离另一端0.5cm处时拿出薄板，用铅笔将最远处做好记号，吹干样品点，测量l1、l0，计算Rf,
15、3、展开 薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过1cm。将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下（点样面朝上），浸入展开剂中。盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在板上标上展开剂前沿位置。吹干，观察斑点位置，计算Rf值。,四、实验关键及注意事项：,1、薄层层析时，薄层板的制备要厚薄均匀，表面平整光洁。2、点样时，各样点间距11.5cm，样点直径应不超过2mm，不能太靠边。3、柱层析时，柱子要致密紧实，无气泡。洗柱、分离时洗脱剂液面不能低于柱中填充物上面。,吸附剂的吸附力强弱，是由能否有效地接受或供给电子，或提供和接受活泼氢来决定。被
16、吸附物的化学结构如与吸附剂有相似的电子特性，吸附就更牢固。常用吸附剂的吸附力的强弱顺序为：活性炭、氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙、石膏、纤维素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力最强。吸附剂在使用前须先用加热脱水等方法活化。大多数吸附剂遇水即钝化，因此吸附层析大多用于能溶于有机溶剂的有机化合物的分离，较少用于无机化合物。洗脱溶剂的解析能力的强弱顺序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。为了能得到较好的分离效果，常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合，得到合适洗脱能力的溶剂系统，以获得最佳分离效果。,吸附层析,在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和
17、有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等，这些亲水物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配比率不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。,分配层析,离子交换层析,支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。带阳离子基团的，如磺酸基（SO3H）、羧甲基（CH2COOH）和磷酸基等为阳离子交换剂。带阴离子基团的，如DEAE（二乙基胺乙基）和QAE（四级胺乙基）等为阴离子交换剂。离子交换层析只适用于能在水中解离的化合物，包括有机物和无机物。对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。离子交换基团在水溶液中解离后，
18、能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同的交换常数，K值愈高，被吸附愈牢。洗脱时，增加溶液的离子强度，如改变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。洗脱过程中，按K值不同，分成不同的区带。,支持物是人工合成的交联高聚物，在水中膨胀后成为凝胶。凝胶内为内水层，凝胶周围的水为外水层。控制交联度以形成不同孔径的网状结构。凝胶只允许被分离物质中小于孔径的分子进入，大于孔径的分子被排斥在外水层，最先被洗脱下来。而进入孔径的分子也按分子量大小大致分离成不同的区带。选择不同规格的凝胶，可把一个混合物按分子量的差异分成不同的组分。这种方法曾被称为分子筛。目前常用的凝胶商品有：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和聚苯乙烯凝胶等。,凝胶过滤层析,
