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1、第三章 高效液相色谱法,第一节 高效液相色谱法的特点,以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法 引入气相色谱法的理论，在技术上采用新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化,一、经典液相柱色谱法与高效液相色谱法的比较,二、气相色谱法与高效液相色谱法的比较,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别、流动相的差别、操作条件差别,分析对象的差异,GC 能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品不可检测 占有机物的20%HPLC 溶解后
2、能制成溶液的样品 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及 高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%,流动相差别,GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力 只与固定相作用,流动相差别（续）,HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性,操作条件差别,GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,三、高效液相色谱法的特点,（1）高压：供液
3、压力和进样压力可达5104kPa（2）高速:流动相流速加快（3）高效:柱效可达3万塔板/米以上。（4）高灵敏度:10-1610-9克（5）选择性高：可以通过流动相的控制来改善分离过程的选择性（6）应用范围广,四、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素,热力学理论：塔板理论平衡理论 基础动力学理论：速率理论Vander方程,（一）塔板理论,（二）速率理论,HPLC,H=He+Hd+Hs+Hmm+Hsm,固定相传质阻力,流动流动相传质阻力,滞留流动相传质阻力,涡流扩散,分子扩散,1、涡流扩散项He,He A=2dp,2、分子扩散项Hd,样品在色谱柱中滞留的时间愈长，色谱谱带的分子扩散也愈严重。Dm10-5
4、 cm2/s（比在气体中要小45个数量级），所以在液相色谱中，纵向分子扩散项实际上可以忽略,3、传质阻力项,(1)固定相传质阻力项Hs：,(2)流动相传质阻力项：流动的流动相的传质阻力Hmm,滞留的流动相的传质阻力Hsm,Van Deemter方程,分子扩散和传质阻力对板高的贡献,固定相粒度大小对板高的影响,（三）影响谱带展宽的其他因素,柱外效应,第二节 高效液相色谱仪,液相色谱的基本流程图,流动相,泵,色谱柱,检测器,泵输液,分离,检测,记录,进样阀,进样,一、贮液和脱气装置,1 储液罐 材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚酮（PEEK）容积：0.52.0L 放置位置：高于泵体，保持一定
5、的输静压差 注意：密封、过滤,2、流动相-过滤、脱气,流动相过滤的目的 过滤去除可能存在的微小固体颗粒，保护色谱高压泵和色谱柱流动相过滤方法,在线过滤,抽真空过滤,过滤用膜：水系和有机 孔径：0.22m和0.45m,流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化,常用的脱气方法有：吹氦脱气法：原理：利用氦气在液体中的溶解度比空气低。特点：效果好，适合所有溶剂，但成本高，使用较少加热回流法：脱气效果也比较好抽真空脱气法：特点：可以一次完成过滤和
6、脱气任务 注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶剂体系超声波脱气法 简单，但效果不理想,常用的脱气方法（续）,在线真空脱气法 把真空脱气装置串接到储液系统，结合膜过滤器可以实现流动相的连续在线真空脱气。,二、高压输液系统,高压输液泵性能：泵体材料耐化学腐蚀 能在高压下连续工作 输液流量范围宽 输出流量稳定、重复性高：流量控 制的精密度应小于1%（最好为0.5%），重复性 最好为0.5%,高压输液泵分类：恒压泵和恒流泵,1、恒流泵 输出恒定体积流量的流动相 注射型 恒流泵 往复型 双柱塞往复式并联泵 双柱塞往复式串联泵,往复型泵 目前使用的是双柱塞往复式并联泵和双柱塞往复式串联泵,往复
7、型泵,优点：可以在高压下连续以恒定的流量输液 液缸容积很小，柱塞容易密封，造价低 更换溶剂方便，特别适用于梯度洗脱,往复型泵,缺点：流动相存在脉动，难以用折光示差检测器进行定量分析 柱塞式往复泵、柱塞和流动相直接接触，易造成污染 长期运转后，流动相中的某些机械杂质会造成单向阀阻塞或阀球磨损不能关闭单向阀，使泵不能正常运转 柱塞式往复泵是HPLC中应用广泛，也是最重要的高压输液泵,双柱塞往复式串联泵示意图,2、恒压泵（气动放大泵）输出恒定压力的泵优点：能以比较简单的方式建立高压并输出无脉动的恒压流动相液流适合和折光示差检测器配合使用可以利用改变气源压力的方法来调节载液流速,缺点：不能输出恒定流量
8、的流动相 色谱峰的重复保留时间差 不能获得可靠的定性结果 液缸体积大（约70ml)，更换载液时操作不便 目前恒压泵主要用于色谱柱的制备，配合装柱用的匀浆装柱机，可以快速建立所需的高压输出,单液缸气动放大泵示意图,气动放大泵是利用气体为动力源，通过帕斯卡原理把气体的压力放大成流动相的压力,3、输液系统的辅助设备 主要有管道过滤器、脉动阻尼器、由压力传感器组成的压力测量、显示装置，以及流动相流量的测量装置4、梯度洗脱装置 梯度洗脱技术可以提高柱效、缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它类似于GC种使用的程序升温技术 影响梯度洗脱的主要因素有：溶剂的纯度、溶剂的互溶性、检测器的种类,四元低压梯度系统,
9、三、进样装置,1、进样器进样 进样前打开流动相泄流阀 用注射器进样 关闭泄流阀，完成一次,2、六通阀进样装置,一定不能使用尖针！它会严重刮坏转子垫圈,进样针,3、自动进样器 工作站按预定程序自动完成取样、进样、复位、样品管路清洗和样品盘的移动等所有步骤,高压进样环进样原理,样品瓶置于进样针下方,高压进样环进样原理,进样针穿过垫圈进入瓶中,高压进样环进样原理,注射器抽取所设定的样品体积,高压进样环进样原理,进样针收回,高压进样环进样原理,转入针端口使之并成为流路的一部分,功能的拓展：,进样针的位置可以上下调节；利用进样程序进行某些柱前衍生化反应例：氨基酸的衍生化反应“三明治”式进样可以自动混合
10、茚三酮衍生，用紫外检测器 邻苯二甲醛衍生，用荧光检测器,四、分离系统,1、柱材料和规格 不锈钢管 柱管的内径：0.5 4.6mm 填料粒度：3 10 m 柱长度：10 50 cm,2、色谱柱色谱性能的评价,评价内容：分离效能、对指定溶质的选择型、在不同PH介质中的稳定性、不同批次但同型号填料间性能的重现性、适宜的操作压力等。性能评价方法：以指定的一组标准溶质为样品，测定它们在柱子上的理论塔板数，作为柱效的衡量指标。例：对于反相色谱填料，可以选择一组具有不同极性的芳香族化合物，如：苯、萘、菲或苯、甲苯、二甲苯等作为基本组分，再加以苯酚或苯胺等酸、碱性溶质。,五、检测系统,主要作用：监测经色谱柱分
11、离后的组分浓度变化，并由工作站记录数据，定性、定量分析。,（一）概述,1、理想的检测器应具备的特性 第一：具有高灵敏度和可预测的响应 第二：对样品所有组分都有响应，或具有可预测的特异性，适用范围广 第三：温度和洗脱液流速的变化对响应没有影响 第四：响应与洗脱液组成无关，因此可作梯度洗脱 第五：死体积小，不造成柱外谱带扩展 第六：使用方便、可靠、耐用，易清洗和检修,第七：响应值随样品组分量的增加而线性增加，线性范围宽 第八：不破坏样品组分 第九：能对被检测的峰提供定性和定量信息 第十：响应时间快,检测器的种类,可变波长紫外可见光检测器光电二极管阵列检测器示差折光检测器荧光检测器蒸发光散射检测器电
12、导电化学和脉冲安培检测器质谱检测器,2、衡量检测器的指标,灵敏度 S=R/QR是检测器响应值的增量Q是样品量的增量噪音 没有样品时检测器的最大输出信号漂移 检测器在一段时间内响应值的变化线性动态范围最大线性相应与最小检出限之比最小检测限样品产生两或三倍于噪音信号时的浓度信噪比S/N注意最小检测限不是一个单纯的检测器指标。它实际上是评价整个色谱系统的指标，包括了色谱系统、分离机理、色谱柱在内的综合性指标，信噪比亦如此,（二）紫外检测器,原理：基于被分析组分对特定波长紫外光或可见光的选择性吸收定量基础：比耳定律，,比耳定律,光能量 I0=入射光强度 I=透过光强度光通量(透过率%)T=I/I0吸光
13、度 A=-log(T)=log(I0/I)吸光度 A=abc,流动池示意图,定波长检测器紫外检测器种类 可变波长检测器 二极管阵列检测器DAD,第一种类型：固定波长紫外检测器,光源 低压汞灯，发出90%的254nm波长的光 锌灯，发出214nm波长的光 镉灯则为229nm和326nm 特点：结构紧凑、造价低、操作维修方便、灵敏度高，适于梯度洗脱 只能对具特征波长有吸收的物质进行检测,第二种类型：可变波长紫外检测器,氘灯190600 nm,新发展 可以 高灵敏度4 波长同时检测 根据4波长测定得到的吸收值之比判断峰的纯度 具有DAD检测器的相似功能,第三种类型：光电二极管阵列检测器（DAD）,光
14、电二极管阵列检测器,DAD检测器的主要特点：,可以同时得到多个波长的色谱图，可以计算不同波长处的相对吸收比可以在色谱分离同时，对色谱峰的指定位置实时记录吸收光谱图，并得到最大吸收波长在色谱运行期间，可以逐点进行光谱扫描，得到时间波长吸收值为坐标的三维图形,DAD检测器的主要特点（续）可以选择宽波带进行检测，一次就能把所有组分检测出来 DAD检测器的一些特殊功能：.色谱峰的准确定性.进行峰纯度的检验.选择最佳波长.建立光谱库，检索被测样品的光谱,例：山梨酸和苯甲酸部分 分离的色谱峰a.山梨酸b.苯甲酸c.混合物,紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较,普通检测器,光电二极管阵列检测器,（三）
15、荧光检测器（FLD）,荧光检测器是利用测量化合物荧光强度，对化合物进行检测的检测器。在实验条件固定，样品浓度较低时，荧光强度与样品浓度呈线性关系，因此荧光检测器是浓度敏感性检测器，可直接用于定量分析,主要特点：灵敏度高（高于紫外吸收检测器两个数量级）选择性好 产生荧光的必要条件：第一：物质分子中具有能吸收激发光能量的吸收带，即物质分子必须具有一定的吸收结构 第二：物质分子吸收了激发光能量之后具有高的荧光效率定量分析时线性范围较窄,受外界条件的影响小当所选用的流动相溶剂不发射荧光，FLD就能适用于梯度洗脱最小检测浓度可达0.1ngml，适用于痕量分析氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物及某些代谢药物
16、都可以用荧光法检测,原理：化合物受到紫外光的照射后，吸收辐射能，发出比吸收波长长的特征辐射，这种特征辐射光线就是荧光,测定发出的荧光能量即可定量,主要包括：激发光源、选择激发波长用的单色器、流通池、选择发射波长用的单色器、用于检测发光强度的光电检测器,目前使用比较多的是激光诱导荧光检测器。组成与普通的荧光检测器一样。两者的主要区别为光源，前者光氙弧灯（连续式、脉冲式），后者的光源是激光器，使用较多的是小功率的Ar离子激光器,（四）示差折光检测器（DRD）,原理：示差折光检测器是通过连续监测参比池和测量池中溶液的折光指数之差来测定样品浓度,是通用型检测器,如果选择合适的溶剂，几乎所有的物质都可以
17、检测特别适用于检测没有紫外吸收的化合物,例如糖类,醇类,酯类以及脂肪酸等高分子化合物GPC,GFC分析以及复杂样品纯化对温度变化敏感不能用于梯度洗脱不宜用于痕量分析,标准糖类混合物(单糖和糖醇),样品：1.麦芽三糖 2.蔗糖 3.葡萄糖 4.半乳糖 5.果糖 6.甘露醇 7.阿拉伯醇 8.山梨醇,分析条件：柱：CHO620(Ca 2)聚合物柱洗脱液：蒸馏水流速；0.5ml/min温度：90 dig.C.检测器：RI进样量：20微升,（五）电化学检测器（ECD）,电导检测器是一种选择性检测器，用于检测阳离子和阴离子，在离子色谱中应用广泛,特点：灵敏度高，最小检测量一般为ng级，有的可达pg级 选
18、择性好，可测定具有电解活性物质（亦可测定大量非电活性物质中极痕量的电活性物质）线性范围宽，一般为45个数量级 测量时要恒温，不宜用于梯度洗脱设备简单，成本较低；易于自动操作,安培检测器 极谱检测器 电化学检测器 库仑检测器 电位检测器 电导检测器,(六)其它类型检测器,通用型质量检测器应具备的性能:样品结构不需要具备紫外发色团或合适的折射率对梯度洗脱和流动相系统温度变化不敏感对各种物质的响应因子很近在一次分析中可以同时检测主要成分和杂质,目前最能接近这些要求的检测器为蒸发光散射检测器。它包括蒸发光散射检测器和凝聚成核光散射检测器。优点：与示差折光检测器相比，灵敏度高，对流动相系统温度变化影响不
19、敏感，可进行梯度洗脱,A.蒸发光散射检测器(ELSD),蒸发光散射检测器（续）,与紫外检测器相比的优点 能解决最困难的HPLC的检测问题 没有流动相和杂质的紫外吸收干扰，提高了检测灵敏度和色谱峰的分辨率 无需测定定量校正因子缺点：要受到样品组分和流动相的挥发性影响，即：样品组分应该是非挥发性或半挥发性的，而流动相应该是易挥发性的溶剂,蒸发光散射检测器原理示意图,B.手性检测器,在现有的检测器基础上，手性化合物的HPLC分析方法有：使用手性柱，方法使用方便、效果好，但手性柱价格贵、寿命短、且通用性差在流动相中加入手性试剂，使被分析物和手性对离子形成离子对，用普通条件即可分分离通过衍生化处理 应用最多的手性检测器是：圆二色液相色谱检测器和以二极管激光器做光源的旋光检测器,C.分子量检测器D.放射性检测器E.热学性质检测器F.化学发光检测器,六、色谱工作站,色谱工作站的主要功能：（1）自行诊断功能（2）全部操作参数控制功能（3）智能化数据处理和谱图处理功能（4）进行计量认证的功能（5）网络运行功能,
