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1、微生物限度检查解读,蔡美明2005.11,一、前言,1.规定了微生物限度检查的定义及检查内容。2.实验的环境设施及操作的无菌要求。3.对检查中使用的助溶剂、中和剂、灭活剂的作用及对微生物生长和存活的影响应进行验证4.霉菌培养温度改为2328，控制菌培养温度改为以3537表示，细菌不变。5.增加检验结果的单位：10g，10ml。,二、具体内容,1.检验量：指明了检验量是一次试验所用的量；对贵重药、微量包装药可酌减，但不规定3g或5g；因沙门菌检查的报告单位为10g或10ml，所以检验量应另增10g或10ml（不含阳性对照用量）。,2.供试液制备（与2000年版药典相比的不同点）,3.细菌、霉菌、
2、酵母菌计数,3.1平皿法：3.1.1平皿法两版药典比较3.1.2平皿法菌数报告规则 3.1.3平皿法其他内容，如阴性对照试验等等与2000年版相同,3.细菌、霉菌、酵母菌计数（续）,3.2薄膜过滤法(为2005年版药典新增内容)3.2.1操作3.2.2阴性对照试验3.2.3培养和计数3.2.4菌数报告规则,3.1.1平皿法两版药典比较,3.1.1平皿法两版药典比较（续）,3.1.2平皿法菌数报告规则,2000年版药典存在许多不足，2005年版作了较大改动1)规定取两位有效数字报告。在计数及中间计算过程中可多保留一位。2)2005年版中：（1）与2000版相同,3.1.2平皿法菌数报告规则(续)
3、,（2）当比值2时，与2000年版相同，以两级均数报告当比值2时，规则与2000年版不同，如比值为25时，说明两级之间存在较大差别，应以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数 增加了比值大于5，或出现高稀释级菌数大于或等于低稀释级，应查明原因。如试液有较强的抑菌作用，就不能象上述一样忽略，必须调整方法,3.1.2平皿法菌数报告规则(续),（3）与2000年版相同（4）与2000年版相同,3.1.2平皿法菌数报告规则(续),3)还删除了2000年版中不合理的3条;把培养基稀释列为具抑菌活性供试品在任何情况下通用的方法，不仅仅局限于某种情况,而且方法也进行了合理的调整，取样改为2ml，每1 ml
4、所注平皿多个(不定),3.2薄膜过滤法(为2005年版药典新增内容),3.2.1操作：1）取相当于供试品1g（ml）的供试液如取供试品1g（ml）或1：10供试液10 ml或1：100供试液100 ml，加至适量稀释剂，混匀，过滤2）冲洗方法、冲洗液、冲洗量（应验证）3）每种培养基至少制备一张膜,3.2薄膜过滤法(续),3.2.2阴性对照试验:等同于“空白试验”，即不加供试品，按同法操作所得结果，每种培养基均需做。,3.2薄膜过滤法(续),3.2.3培养和计数:与平皿法相同。但每张滤膜上菌数应不得过100个，如果超过100个，也就是每1g（ml）供试品含菌量较多，可取适宜稀释级供试品1ml检查
5、，例如，1：10取10ml检查，菌落150个（150个/g），则改用1：10取1ml检查，菌落为15个（150个/g）,3.2薄膜过滤法(续),3.2.4菌数报告规则:1)报告每1g（ml）供试品菌落数；2)若膜上无菌落生长时，如果（每张膜过滤1g(ml)供试品或1：1010ml供试液，如每张膜过滤1：1010ml供试液，则报告10个，依此类推，为1乘以稀释倍数,4.控制菌检查,1)大肠菌基本相同，主要修改是：当MUG和靛基质两项中有一项为阳性时，大肠菌的进一步确认通过大肠菌菌落形态特征比较进行鉴别排除，增加大肠菌形态特征，对进一步确认做什么生化试验不作硬性规定（是否妥？），所以原有的生化试验
6、结果判断删除了。,4.控制菌检查(续),2)增加大肠菌群检查。3)沙门、金葡、绿脓也和大肠菌一样作了调整，大同小异。沙门菌规定取供试品1 0 g（ml），另加阳性对照10 g（ml）。4)增加了梭菌检查（无论试管或平皿都要注意厌氧条件培养）。,5.微生物限度标准,（略）主要变化是由按剂型控制改为按给药途径控制。,6.方法验证,6.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：1)菌液制备（略）2)验证方法：主要分四组，测得四组数据。供试品对照组：按拟定的菌落计数方法，准确测定规定量(与试验组的相同)的供试液中的菌落数，得供试品的已知含菌数-相当于已知供试品的含量。菌液组：测定所加的试验菌的菌数-相当于精
7、密称定对照品，得对照品的已知加入量。,6.方法验证(续),试验组（操作略）：取已知含菌数的供试液（试验可能用的最低稀释级供试液1ml）和一定量的试验菌，进行测定。测得试验组的总菌量，测定两份（两个平皿），求平均值 计算试验组的回收率：试验组-供试品对照组（加入试验菌的测定值）菌液组（加入试验菌的已知值）（应70%）,6.方法验证(续),稀释剂对照组：以相应稀释液替代供试品，按试验组同法测定 计算稀释剂对照组的回收率：稀释剂对照组（加入试验菌的测定值）菌液组（加入试验菌的已知值）（应70%）,上述整个试验应至少进行3次独立的平行试验，即分别平行取来自同一批样品的三份供试品，平行操作，作三次验证测
8、定。每次验证试验的试验组和稀释对照组回收率必须两项同时70%，所被验证的检查法成立，否则,6.2控制菌的验证,根据各品种项下微生物限度检查标准中规定检查的控制菌，进行相应的验证；根据检查的控制菌选择对应的验证菌，大肠菌群选大肠埃希菌。试验分二组,试验组（操作略）：规定量一般为1：10供试液10ml（相当于1g或1ml供试品），沙门菌除外。取供试液、试验菌加入增菌培养基中。按拟定方法检查。,阴性菌对照组：检查大肠、大肠菌群、沙门-金葡为阴性检查绿脓、金葡、梭菌-大肠为阴性 进行阴性试验时，取供试液及阴性对照菌，然后按控制菌检查的方法进行试验，例如，验证控制菌大肠菌的检查方法时，应取供试液及金葡菌
9、，按大肠菌检查方法进行增菌检查，应不得检出金葡菌。本阴性菌对照组试验的目的是为了验证大肠菌检查方法的专属性,7.总结,作为研发者，需要做的工作是：(1)建立方法；(2)验证方法；(3)制订质量标准 作为检验者，应该做的工作是：-按制订的方法（质量标准）检验,10号资料（质量标准研究资料）,(1)实验仪器、试药（包括培养基、稀释液、冲洗液、菌液，包括培养基的相关试验）(2)根据什么原因、理由、依据 拟定的方法,(3)按药典要求进行验证，主要实验操作(4)验证数据、结果，列表表示(5)得出结论,总而言之，无菌检查、微生物限度检查，目的是检查药品中是否污染了微生物，污染的程度怎样？为了要能准确地检测其结果，必须排除实验环境、实验仪器设备、实验用试药材料、实验操作以及药品本身等等，对所污染微生物的生存、生长，产生任何不良影响的因素。上面所涉及的内容，就是为了达到这个目的,谢谢大家,
