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1、高效液相色谱,概述 HPLC 理论基础 HPLC 主要类型 HPLC 仪器 HPLC 应用,第一节 概述,高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。,一、HPLC与经典LC区别二、HPLC与GC差别三、特点及应用,一、HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段。,1经典LC：仅做为一种分离手段。柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀。重力加料输送流动相。柱效低（H，n）。分析周期长。无法在线检测。,2HPLC：分离和分析 柱内径2-6mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱）高压输送流动相。柱效高（H，n）。分析时间大大缩短
2、。可以在线检测。,二、HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测。主要差别：分析对象的差别和流动相的差别。,1分析对象：GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品;高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测；占有机物的20%。HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制。分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测；占有机物的80%。,2流动相差别：GC：流动相为惰性气体。组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。HPLC：流动相为液体。流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用。流
3、动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用。选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相。可以增大分离选择性。,3操作条件差别：GC：加温操作。HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）。,三、HPLC的特点和应用,“三高”“一快”“一广”,高柱效n=104片/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）,第二节 基本理论,热力学理论：塔板理论平衡理论基础动力学理论：速率理论Vander方程,一、塔板理论,二 速率理论,GC:H=A+B/U+CU(填充柱)H=B/U+CU(毛细管柱)HPLC:H=A+CUB=2D,对于HPLC，因Dm较小，B项可
4、忽略,三、HPLC法中分离条件的选择,1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定（dp10m）。首选化学键合相，匀浆法装柱。2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相。3.柱温的选择：选室温250C左右,液相色谱仪：高压输液系统进样系统分离系统检测系统记录系统,第三节 高效液相色谱仪,工作过程图,仪器构造图,1高压输液系统高压泵 对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。还应耐腐蚀，密封性好。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，
5、且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。,恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化。有机械注射式和机械往复式两种。每分钟往复25100次，脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器。,在线脱气装置 在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱，脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘溢，噪音增加,也可采用超声脱气和真空脱气。,A,A,C,2进样装置 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制
6、，因此进样准确，重复性好。,3色谱柱 一般直径26mm,柱长1030cm,(尺寸排阻色谱柱常大于5mm；制备色谱柱内径更大，可达25mm以上)。,4检测器 1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质。2）示差折光检测器：利用折光率的差别，灵敏度低，温度要求严格。3）荧光检测器：只能分析自身发光的物质，灵敏度高。4）电化学检测器。5）其它检测器：MS、IR、光散射、极谱。,紫外检测器其检测原理采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm，体积约为110 L HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能
7、小于溶剂的最低使用波长。,示差折光检测器：原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。,荧光检测器 许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的荧光活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高23个数量级。电导检测器 电导检测器主要用于离子色谱的检测 其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。
8、电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当pH7时，该检测器不够灵敏。,第四节 HPLC流动相和固定相简介,一、流动相理想的溶剂应有下列特性：1）避免使用引起柱效损失或保留特性变化的试剂。2）与检测器相匹配。3）高纯度：否则基线不稳或产生杂峰。4）化学稳定性好。5）适宜的粘度：粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。二、固定相载体 由于各种HPLC分离方法的流动相均为液体，因此，HPLC通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。,1.按承受压力分：刚性固体：SiO2为基质，耐压为7.01081.0109 Pa。可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒
9、；主要用于吸附、分配和键合色谱。硬 胶：以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成)，耐压上限为3.5108 Pa,主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。2.按孔隙深度分：表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分析。全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、传快、柱效高。特别适于复杂混合物的分离。,第四节 HPLC主要类型,一、吸附色谱（adsorption chromatography）原理：基于被
10、测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。固定相：固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。,流动相：弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等 应用：吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象,二、分配色谱原理：根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数。流动相:HPLC分析中，为防止固定相的流
11、失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）。,固定相原则上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：，-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、十八烷(C18)、角鲨烷(SQ)。根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。1）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多
12、孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。,2）化学键合固定相 化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理),高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；特点如下：传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快 寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击 耐水、耐光、耐有
13、机溶剂。选择性好，可键合不同官能团，提高选择性,有利于梯度洗脱。,Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。,应用：液液色谱是基于化合物中取代基的数目或性质不同，或化合物的相对分子量不同达到分离的。能分析各种不同性质的样品，无论极性化合物还是非极性化合物,可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长（极性越小），分离效果越好,三、离子交换色谱1 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（
14、或离子交换能力）的差别来实现分离的。应用：适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。,2 固定相：作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分。,常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种：多孔型离子交换树脂：它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为520m，有微孔型和大孔型之分 薄膜型离子交换树脂：它是在直径约对30m的固体惰性核上，凝聚12m厚的树脂层。表面多孔型离子交换树脂：它是在固体惰性核上，覆盖一层微球硅胶，
15、再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。,离子交换键合固定相：它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离,3 流动相pH值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度I：对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将降低样品离子的竞争吸附能
16、力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子L：当大量L、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：RM-L+X RM-X+L，该法用于分离各种氨基酸或碱类。,四、离子色谱,离子色谱(IC)是70年代发展的新方法。其分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。为解决此问题，1975年Small 提出，
17、在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。,例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：R+OH+HCl(流动相)R+Cl-+H2OR+OH+MCl(待测物)R+Cl+M+OH-由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度为Cl-离子的2.6倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样
18、品也有相似的作用机理,该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液(如苯甲酸盐稀溶液)作流动相称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱,五、离子对色谱,离子对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱原理:离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法 例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子A-有相反电荷的离子B+：由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子A1，A2，A3.因
19、与B离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的,阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子。阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子。反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。,六、尺寸排阻色谱法,尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。分离原理：固
20、定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小(分子量大小)先后从柱中流出。,尺寸排阻色谱的特点：（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息（2）保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10才能得以分离,排阻色谱固定相,排阻色谱流动相 必须能溶解样品，并必须与凝胶本身
21、非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶 另外，溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意 必须与检定器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等,七、亲合色谱应用：主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行选择性分离及纯化的方法。分离原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称为间隔臂），然后再连接上配基，如酶、抗原或激素，当含有复杂混合试样的流动相流经这种经固定化的配基时，其中具有亲合力特性的生物大分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被洗出；随后，改变流动相p
22、H或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。特点：选择性过滤、纯化效果好。,第五节 HPLC的应用,食品检验环境监测生命科学药物分析合成化学石油化学临床化学法学检验,一.在食品分析中的应用 1食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等；2食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等；食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃等。二.在环境分析中的应用 多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药（如氨基甲酸脂类，反相色谱）残留等,三.在生命科学中的应用HPLC技术在生化领域的应用主要集中于两个方面：1.低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定。2.高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定。,四.在医学检验中的应用 体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测：1.合成药物：抗生素、抗忧郁药物（冬眠灵、氯丙咪嗪、安定、利眠宁、苯巴比妥等）、黄胺类药等。2.天然药物生物碱（吲哚碱、颠茄碱、鸦片碱、强心甙）等。,
