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1、第三章 微载体培养技术（microcarrier culture technique）,一、何谓微载体？指直径60-250m，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。,最初采用在培养液中加人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的贴壁面积。,此方法构造简单，成本低，重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的增加。,但产率低，劳动强度大，占空间大。,如何增加细胞生长的贴壁面积？,1967年被用于动物细胞大规模培养。兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。现广泛用于培养各类细胞，生产疫苗、蛋白质产品。,微载体培养系统,培养4h，微载体间的细胞“桥联”200,电镜下串在一起的肝细胞微
2、载体730,由于肝细胞的粘附作用微载体形成“串珠”400,脊髓灰质炎、狂犬和乙脑等疫苗,二、微载体的商品类型,第一种微载体：Van Wezel用DEAE-Sephadex A50研制而来,市售（国际）种类有十几种以上：,液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等,常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline,显微镜下的高密度微载体,优良的微载体应具有的特性,价廉，能重复使用。,不含能毒害细胞的成分；,微载体须与细胞有良好的相容性；,密度应略大于培养基；,粒径在40120m
3、范围，生理盐水溶胀后增大到60250 m，粒度分布地均匀，径差不大于2025m；,良好的光学透明性；,能在PBS中耐120125、2030min高温灭菌；,应是非刚性材料；,不吸收培养基中的营养成分；,收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋白质分离纯化；,三、微载体培养原理与操作,1、原理：将对细胞无害的颗粒微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。,微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200m之间。,微载体的密度：一般为2，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大
4、。,微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。,细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。,细胞增殖阶段：黏附贴壁、生长和扩展成单层,贴壁依赖性细胞在微载体表面上：,贴附是进一步铺展和生长的关键，主要是靠静电引力和范德华力,Vero细胞在Cytodex-3微载体表面粘附铺展的形貌变化,通常做法：贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。,2、搅拌转速：动物细胞无细胞壁，对剪
5、切力敏感，无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。,搅拌速率越大，制得的微球越小，聚合物浓度越大，制得的微球较大,以聚己内酯（PCL）、聚左旋乳酸（PLLA）、聚乙醇酸聚乳酸共聚物（PGLA）为基质制备可生物降解微载体,3、细胞与微载体的相融性：与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理pH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。,4、细胞在微载体表面的生长 受影响因素：细胞方面：细胞群体、状态和类型。微载体方面：微载体表面状态、吸附的大分
6、子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。培养环境中：培养基组成、温度、pH、DO以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。,微载体系统培养细胞的步骤：,(1)选择合适的微载体类型,(2)浸泡水化及消毒,(3)接种,(4)培养观察与细胞记数,(5)消化,(6)分离细胞,(7)传代培养,交联葡聚糖纤维素为基质微载体蛋白质为基质微载体（变性胶原微载体:蛋黄色，表面特性好，易与细胞结合）高分子材料为基质微载体无机玻璃基质微载体,微载体基质,PCL微球表面多皱，PLLA微球表面布满坑洞，PGLA微球表面光滑,不同种类聚酯的微球表面形貌差
7、异,多孔载体培养,优点:降低血清用量，增加细胞固定性。生长空间大，免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量，强化传质。多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细胞的固定化连续灌流培养。多孔载体固定细胞过程简单，对细胞无毒害和损伤，细胞可从长满细胞的微载体中自动转移到未长细胞的新载体上生长，接种方便，培养简单，特别适合于反应器大规模培养。,多孔载体制备的材料选择,(1)生物相容性：材料对细胞必须无毒害，对贴壁细胞有良好的黏附作用。(2)机械稳定性：微载体在长时间搅拌状态下不破碎；同时满足微载体清洗处理、回收利用的要求。(3)热稳定性：在121、蒸汽灭菌下不分解、不破碎、不软化。,主要考虑生物相容性、
8、机械稳定性和热稳定性,5、微载体培养操作要点,培养初期：保证培养基与微球体处于稳定的pH与温度水平，接种细胞（对数生长期）至终体积1/3的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所用浓度及接种细胞密度不同，常使用2-3g/L的微载体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。,贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。,培养维持期：进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随着细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液（停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液
9、（37），重新开始搅拌。,收获细胞：首先排干培养液，至少用缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，快速搅拌（75-125r/min）20-30min。然后解离收集细胞及其产品。,微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至4000L以上。,细胞形态饱满、生长良好,细胞形态更加立体，轮廓清晰，细胞数量明显增加，少量微载体上细胞几乎长满,微载体上细胞基本长满，细胞形态健康,微载体上细胞更加致密，细胞密度达到5106个/ml以上,微载体上细胞依然良好，没有明显细胞脱落现象,Marc145细胞微载体培养第1天,Marc145细胞微载体培养
10、第2天,Marc145细胞微载体培养第3天,Marc145细胞微载体培养第4天,Marc145细胞微载体培养第10天,四、微载体培养优点,培养系统占地面积和空间小。,表面积/体积大，因此单位体积培养液的细胞产率高；,把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；,可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；,简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；,培养基利用率较高；,放大容易；,细胞收获过程不复杂；,劳动强度小；,传统方法疫苗生产的流感病毒在鸡胚内培养生产过程：对几百万个蛋胚逐一接种和收获，很难自动化、劳动强度大、时间消耗多，且有污染的可能。,Baxter Biomedical研究中心，奥地利,如今大规模微载体培养Vero细胞生产流感疫苗成为可能,驯化Vero细胞适应在用于大规模生产的无血清无蛋白培养基内生长。中试生产中最终的生物反应器规模是1200升。包括工艺设计，特殊的通气和搅拌装置，可以进一步放大到生产体积为6000升。,关于H1N1疫苗生产,流感疫苗生产的大规模生产区域,(A)细胞培养(B)离心分离(C)超滤、洗滤。,Vero细胞流感疫苗生产图,(A)未感染的细胞(B)早期细胞病变影响(C)收获前的晚期细胞病变,大规模流感病毒生产中细胞病变影响图片,
