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1、细胞破碎及多酚氧化酶的制备,Contents,概念,多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。广义上，PPO可分为单酚氧化酶、双酚氧化酶、漆酶,植物,微生物,土豆的褐变,含有儿茶酚水果的褐变,1.植物中的多酚氧化酶,在植物(如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、桑叶、烟草等)组织中，PPO是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后PPO被活化，从而表现出活性。在高等植物组织发生褐变 主要是PP0活动的结果。,2.微生物漆酶,漆酶
2、是三大类多酚氧化酶中作用底物最广的一类。在真菌中，漆酶大多分布在担子菌(Basidimycetes)、多孔菌(Polyporus)、子囊菌(A-somycetes)、脉孢菌(Neurospora)、柄孢壳菌(Po-dospora)和曲霉菌(Aspergillus)等真菌中。担子菌中的白腐菌是目前获得漆酶的主要来源。,3.微生物酪氨酸酶,酪氨酸酶，又叫单酚氧化酶，它可以氧化L-酪氨酸合成L-多巴和黑色素。在高等动物和人类中酪氨酸酶的活性高低与黑色素的形成速率有关，缺乏此酶将引起白化病。,果蔬中多酚氧化酶的褐变机理,果蔬褐变是指水果和蔬菜加工及其制品在储藏过程中，产生果蔬组织颜色变得灰暗或变成褐色
3、的现象。褐变不仅影响果蔬食品原有的色泽，而且影响其风味和营养价值。,其分为二种类型的酶：邻二酚氧化酶（包括有儿茶酚氧化酶、多酚氧化酶）和单酚氧化酶。,多酚氧化酶催化的类型,对二酚氧化酶（有树胶氧化酶、酪氨酸氧化酶）,在果蔬中，除了具有活性的多酚氧化酶外，还有某些非活性形式或潜在形式。包括酶原形式，已在番茄和马铃薯中发现。细胞膜结合酶部分，使用离子净化剂可增加PPO活性或激活酶本身。,PPO的催化反应的机理,酶活性中心的两个铜原子与O2结合，以氧原子为桥，两个氧原子仍有键连，酶本身由脱氧型变成含氧型。,含氧型酶与邻二酚结合，二个羟基中的氧分别结合在二个铜原子上，同时释放出2个氢离子。,酶、氧及邻
4、二酚形成的复合物与二个氢离子在氧桥上结合，并释放出苯醌。间氧型酶与第二个邻二酚分子结合，结合位点与第一步相同，但两个铜原子之间的一个OH基与氢离子结合，生成一分子水和一个氢离子。,间氧型酶与邻二酚的复合物与另一个H+结合（即两个铜原子之间的另一个OH基与结合），生成一分子水，同时释放出第二分子的苯醌，但氧化前后二个邻二酚的变化并不完全相同。,含有多酚类的果蔬在多酚氧化酶的催化下，首先氧化成邻醌；然后邻醌或未氧化的邻二酚在酚羟基酶催化下进行二次羟基化作用，生成三羟基化合物；邻醌再将三羟基化合物氧化成羟基醌；羟基醌易聚合而生成黑色素。,总结：,果蔬加工中酶褐变的控制的方法,物理控制,热处理 加热是
5、最有效的杀酶方法。瞬时高温可在短时间钝化酶的活性,抑制褐变。,有无副作用呢？,低温贮藏 低温下有效降低PPO活性,延缓呼吸高峰的出现,控制果蔬褐变,延长货架期。气调 通过改变贮藏环境的气体成分,减轻褐变,保持果蔬采后品质。可食膜 使果蔬内部维持相当于气调的高CO2低O2状态,抑制褐变。它具有无色、无味和可食等优点,一般采用蛋白质、油脂和多糖等材料,如纤维素基质、支链淀粉、乳蛋白。,化学控制,亚硫酸盐 亚硫酸盐是传统的褐变抑制剂。但它破坏营养,使组织软化并产生异味,且有害健康,美国FDA已对其使用做出限制。4-己基间苯二酚(4-HR)作为新型抗氧化剂，是酪氨酸酶的有效抑制剂，其化学稳定性相当好，
6、安全性高，对酚酶抑制力强。大量实验发现可抑制微生物生长与果蔬褐变,延长贮藏期。,1-甲基环丙烯(1-MCP)1-MCP是乙烯受体的竞争性抑制剂,延缓了组织软化、衰老和褐变,且无毒、用量低。天然抑制剂 有研究发现外源花青素可抑制采后荔枝果皮脂质的过氧化反应,一定程度维持果皮组织的膜完整性,减轻褐变。,酸处理 抗坏血酸及其衍生物:抗坏血酸可还原醌类,阻止它们转化为有色物质，但不太稳定，而其衍生物如抗坏血酸脂肪酸酯(如十二酸酯,葵酸,棕榈酸抗坏血酸酯)及抗坏血酸-2-磷酸盐也有很好的抗褐变作用。抗坏血酸钙已广泛应用于抑制鲜切果蔬褐变,取得很好效果,但其缺点是价格较贵。,生物技术,通过对果蔬基因改良,
7、选育抗褐变新品种,达到抑制褐变的目的。目前较成功的是反义RNA。由于生物技术可以免除繁琐的灭酶工艺,避免使用抗氧化剂带来的潜在隐患,具有广阔的前景。,关于果实酶促褐变方面的研究很多，褐变机理也比较复杂，目前尚未完全弄清。关键问题集中在对PPO及其底物的研究以及采后贮藏环境对酶促褐变的影响。酶促褐变与果实衰老有密切关系，衰老过程中酶与底物的分区定位遭到破坏是导致酶促褐变的主要原因。PPO合成基因的表达可能与衰老有关。对PPO的深入研究有望从分子水平上搞清酶促褐变的机理，为控制酶促褐变提供新方法。,展望,改变PPO基因的表达 利用反义RNA技术反向表达PPO基因，修饰转基因植株中多酚氧化酶基因的表
8、达，从而控制酶促褐变。目前已成功利用该技术得到了无褐变的马铃薯品系。除了对苹果、梨、茶叶、小麦等作物的报道外，而且对于其它食品中的多酚氧化酶的研究也日渐丰富起来。,实验内容,一、实验目的：（1）学习从植物组织细胞中制备酶的方法。（2）掌握多酚氧化酶活性的测定方法。,二、实验原理,多酚氧化酶是一种含铜的酶，其最适pH值为67。由多酚氧化酶催化的反应，如以邻苯二酚为底物，可以被氧化形成邻苯二醌。由多酚氧化酶催化的氧化还原反应可通过溶液的颜色的变化鉴定，这个反应在自然界中是常见的，如去皮的马铃薯和水果变成褐色就是由于该酶作用的结果。多酚氧化酶的最适底物是邻苯二酚（儿茶酚）。间苯二酚和对苯二酚与邻苯二
9、酚的结构相似，它们也可以被氧化为各种有色物质。,三、试剂及器具,1、材料市售新鲜土豆2、试剂及配制0.1mol/L的NaF溶液:（将4.2g氟化钠溶于1000ml水中）、0.01mol/L的邻苯二酚溶液:（将1.1g邻苯二酚溶解于1000ml水中，用稀氢氧化钠调节溶液的pH值为6.0防止其自身的氧化作用。当溶液变成褐色时，应重新配制。新配制的溶液应贮存于棕色瓶中。最好当天配当天用）、柠檬酸缓冲液:(pH6.0,0.050.1mol/L)、（0.1mol/L：柠檬酸.H2O 3.7818g,柠檬酸钠.2H2O 24.124g）饱和硫酸铵溶液：（761克/1000ml水）3、器具匀浆机、小刀、纱布
10、、烧杯、布氏漏斗、抽滤瓶、量筒、容量瓶、普通离心机、冰箱、恒温水浴锅。,四、实验过程,（一）酶抽提物的制备1、洗去土豆上面的泥土。2、去土豆皮后切成小块3、称取200g土豆块放入匀浆器中，再加入氟化钠溶液200ml。(全班30组共用)4、在匀浆器中机械打碎30s。5、把匀浆物通过几层细布滤入烧杯中。6、每组各自取10mL滤液，(用50mL离心管），然后在滤液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混合后于4放置30min。7、在4000r/min下离心15min，倒掉上清液。8、将沉淀物用大约2ml柠檬酸缓冲液溶解(pH6.0,0.050.1mol/L)，即得该酶粗制品,四、实验过程,（二）多酚氧化酶的颜色反应：1、将3只干净的试管编号为1、2、3。2、按下面的要求制备各管：管1：加入15滴酶抽提液和15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液，混合均匀。管2：加入15滴酶抽提液和15滴水，混合均匀。管3：加入15滴0.01mol/L的邻苯二酚溶液和15滴水，混合。3、把3只试管放于37水浴中。4、每隔5min震荡试管并观察每管中溶液颜色的变化，共反应25min。5、观察现象并记录实验数据。,多酚氧化酶的催化作用：,思考题：,酶的分离提取过程中要注意哪些事项？在酶制备过程中加入硫酸铵的目的是什么？,
