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1、实验六、吲哚乙酸氧化酶活性的测定,南京师范大学 生命科学学院,一，实验目的与要求,了解吲哚乙酸氧化酶的生理功能和分布；掌握测定植物体吲哚乙酸氧化酶活性的方法。,二，实验材料与试剂,1，材料 绿豆幼苗的下胚轴。2，试剂20mmol/L的磷酸缓冲液（pH6.0)；1mmol/L的2、4-二氯酚；1mmol/L的氯化锰；200ug/mL 的吲哚乙酸（少量乙醇溶解后定容）；试剂B：0.5mol/LFeCl3-35%过氯酸(V:V=1:50)，(使用前混合，避光保存）。,三、实验原理,1、知识背景,知识背景：植物的生长物质,定义：调节植物生长发育的物质。分类：1、植物激素（plant hormone）在
2、植物体内合成、并从产生处运送到别处，对发育产生显著作用的微量有机物；2、一些具有植物激素活性的人工合成物质。,五大类激素的生理功能,五大类激素的产生部位,生长素是什么,1934年提取：吲哚乙酸（IAA）,苯乙酸（PAA）,吲哚丁酸（IBA）,具有生长素效应的还有：,生长素的发现,燕麦胚芽鞘,Darwin的向光性实验,燕麦胚芽鞘去除顶端,Darwin的向光性实验,燕麦胚芽鞘加不透明帽子,燕麦胚芽鞘加透明帽子,达尔文的推测：,单侧光照射使胚芽鞘的尖端产生某种刺激，当这种刺激传递到下部的伸长区时，会造成背光面比向光面生长快，因而出现向光性弯曲。,詹森的实验（1910）和拜尔的实验（1914）,詹森实
3、验证明：胚芽鞘尖端产生的刺激物可以透过琼脂片。,拜尔实验证明：弯曲生长是因为顶尖产生的刺激物分布不均匀造成的。,燕麦胚芽鞘去除顶端，加琼脂块,燕麦胚芽鞘去除顶端，加处理过的琼脂块,的实验,实验结论总结,生长素的产生部位：,生长素的作用部位（胚芽鞘的生长部位）,胚芽鞘的感光部位：,胚芽鞘的尖端,胚芽鞘的尖端下段,胚芽鞘的尖端,结论：,胚芽鞘顶端能产生化学物质，向下传输到去顶胚芽鞘，并影响后者的生长；Went称这种化学物质为生长素；1934年首次提取纯化出刺激生长的物质，经鉴定为吲哚乙酸（IAA）。,单侧光使背光一侧比向光一侧生长素分布得多；背光一侧的细胞纵向生长的快，结果使得茎朝向生长慢的一侧弯
4、曲。,生长素为什么能引起向光弯曲？,生长素的产生部位,生长素的分布,生长素的运输方向,主要在幼嫩的芽、叶、发育的种子。,大多集中在生长旺盛的部位。,从植物体形态学上端向形态学下端运输。,根：背向根尖运输,茎：背向茎尖运输,生长素的分布与运输,A,生长素的生理作用和最适浓度,低促高抑,生长素浓度的调节方式：,生长素的结合：束缚生长素 自由生长素,无活性 有活性,与糖、氨基酸等结合,合成、降解、运输、结合、区域化,生长素的降解：,1）光氧化；2）酶促降解,脱羧降解（吲哚乙酸氧化酶IAA oxidase）,不脱羧降解,2、综上所述,吲哚乙酸氧化酶能调节植物体内IAA的水平，从而影响植物的生长。生长素
5、分布在生长旺盛的部位，IAA氧化酶分布在生长不旺盛的部位。酶活力的大小可以用破坏IAA的速率表示，即：IAA氧化酶活力=IAA减少的速率,3、实验设计,在无机酸存在下，IAA能与FeCl3作用，生成红色的螯合物。该物质在530nm处有最大光吸收峰。,比色法（分光光度法）,注意：如果待测物与另一底物反应后 1，生成稳定的产物；2，产物有特定的光吸收峰。,三，实验步骤,1，提取IAA氧化酶 称取0.5g绿豆下胚轴，分次加入预冷的磷酸缓冲液（pH6.0）5mL，冰浴研磨，4000rpm离心20分钟，取上清液，即为粗酶液。,两管分别混匀，25 水浴保温30min。,2，IAA氧化酶与IAA的反应,3，
6、测定IAA氧化酶活性,混合试剂B：0.5mol/LFeCl3+35%过氯酸(V:V=1:50)30min后另取2支试管，每支加入试剂B 4mL，再按表加入反应液orIAA的梯度浓度溶液各2mL。,2支试管于40 下保温30min，使反应液呈红色。530nm处测OD值，分别记为OD实验、OD对照。,4.制作标准曲线,另取7支试管，每支加入试剂B 2mL，再按表加入IAA的梯度浓度溶液各1mL。以0管溶液调零，分别测定530nm处吸光值。,同时，配制IAA梯度浓度溶液各10mL,5、结果计算,以06管的IAA浓度为横坐标，以相应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线。根据实验、对照管的OD值，在标准曲线上查出相应的IAA浓度。IAA氧化酶活性（ugIAA/g FW.h),(C对照-C实验)*VT*V,=,1,VT：酶液总体积；V：步骤2所得反应液体积；V1：反应所用酶液体积,四、思考题,步骤（一）中为何取材时去除子叶与胚根，留取胚轴？反应混和液为何中加入氯化锰和2、4-二氯酚？IAA氧化酶在植物的生长发育过程中一般起着什么作用？为何在生产实践中一般不用IAA，而用NAA或2、4-D等生长调节剂？,
