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1、石油污染土壤生物解决方案,翟一波,石油污染中国现状,从中国开始有油田以来，含油污泥治理目标不明确，落实现状让人担忧，实地考察与报道不实状况屡屡发生，据有关资料显示，2010年，2011年，2012年中国大陆石油污染后的含油污泥、泥沙、钻屑等达1000万吨/年（海上污染不计其内）,沿海污染,内陆污染,油泥被偷偷填埋以后,石油污染现状污染严重,石油降解菌的由来,随着经济和社会的迅速发展，石油及其制品被广泛地应用于国民经济的各个领域和人类的日常生活中，而且使用量与日俱增。在石油产量激增的同时，石油在开发、储存、运输、加工和应用过程中的泄露和排放对环境的污染也日趋严重。鉴于石油污染危害的严重性，世界各
2、国纷纷研制和开发出了一系列石油污染治理的技术，主要包括物理、化学、生物等方法。生物修复是新近发展起来的一项净化环境的低投资、高效益、便于应用、发展潜力较大的新型技术。由于微生物降解法原理是利用微生物将烃降解成对环境无害的产物CO2和H2O，具有安全、效果好、费用低、处理彻底、无二次污染等优点，成为一种经济效益和环境效益俱佳的、解决复杂环境污染问题的最有效的手段。,美国墨西哥湾漏油事故,美国墨西哥湾漏油事故,渤海漏油事故,石油降解菌的研究方向,对石油降解菌的研究，国内外侧重点有所不同。国外主要研究微生物对原油和芳烃的降解效率,以及微生物对芳烃物质的降解机制国内主要研究石油降解菌的筛选以及降解菌对
3、原油的降解效率,并利用降解菌对石油污染的土壤进行模拟性修复试验,石油降解菌的种类,国外在20世纪40年代就开展了细菌降解油污的研究，我国这方面的研究始于20世纪70年代末期。由于这项研究开启的很早，因此获得的种类较为丰富。已知降解石油的微生物共有70属200余种。细菌有28个属，霉菌30个属，酵母12个属。,石油降解菌的分离筛选,石油降解菌一般从受石油污染的土壤、水中进行分离并筛选。但是为了进一步的应用，还要进行驯化。根据研究目的与要求不同，在筛选时往往控制不同的条件从而得到不同功能的菌落。当然，最多的是根据底物的不同来筛选菌种,以烷烃为底物筛选出的菌落，对烷烃的去除效率会较高，由于烷烃相对于
4、芳烃较易分解，且大部分的石油降解菌对烷烃的降解效果均较好。以48小时为培养周期得到：以烷烃为底物，不动细菌菌属的菌株降解率为69%，芽孢杆菌属的菌株降解率为71%，假单胞菌属的降解率可达73%。以环烷烃为底物，得到不动细菌菌属与芽孢杆菌属的菌株，石油降解率均为67%。,研究最多的是直接以原油为底物进行筛选。目前此类报道已经很多，而且培育出了很多高效降解菌，大部分效率在30%以上，有些甚至都已超过70%。但是如果要得到抗逆性较好的菌种，就需要在一些极端的环境中进行取样，进行分离筛选。,石油降解菌降解机理研究,石油烃在微生物表面的吸附及在微生物细胞膜的运输 石油烃在水中的溶解度很小，且容易吸附在土
5、壤颗粒上，很难直接被微生物利用。环境中存在的表面活性剂对石油烃具有一定的增溶和分散作用，为微生物吸附石油烃做了贡献。微生物还通过自身的适应性机制来提高对的利用率。对此目前存在两种解释：,一种是特异性附着机制微生物通过菌毛或细胞膜的脂类和蛋白使细胞形成疏水表面而附着于水中的油滴上另外一种是烃类乳化机制微生物通过释放出乳化剂将油滴乳化成小颗粒，增大油滴的表面积，有利于微生物的直接接触和利用,石油烃在微生物细胞膜的运输是微生物降解的重要环节之一，但关于石油烃如何通过细胞膜目前还不很清楚。现在的跨膜运输理论主要存在被动运输和主动运输两种。但是也有研究表明，微生物自身产生的生物表面活性剂也能使微生物细胞
6、膜结构发生改变，从而引起污染物通过细胞膜的机会大大增加。研究发现有些表面活性剂能够集合排列在微生物细胞膜的表面，有的甚至还可以镶嵌在细胞膜中，从而在细胞膜表面形成类似通道的孔状结构，使更容易通过细胞膜进入细胞体内。,阳离子表面活性剂红细胞表面带有负电荷，阳离子表面活性剂通过静电作用吸附于其表面，这提示除了磷脂的溶解外，还有其他机制介入细胞膜溶解。阳离子表面活性剂作用于磷脂，把它们和蛋白质分离开来，而导致细胞膜的溶解。,阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂不能通过静电作用吸附于细胞膜表面，但具有长链疏水基团的表面活性剂可拮抗其和细胞膜之间的静电排斥力而吸附于其表面，其作用机制可能是通过离子和疏水键作
7、用吸附于膜蛋白上，当它改变了蛋白质的结构后，就导致了细胞膜的溶解。阳离子表面活性剂溶解磷脂的能力10倍于阴离子表面活性剂，然而具有长链的碳氢化合物的阴离子表面活性剂比阳离子表面活性剂的溶解效率更高。,非离子表面活性剂一些非离子表面活性剂，以TritonX-100为代表，具有很强的溶解能力，非离子表面活性剂的吸附和溶解机理还不十分清楚。Sasaki等人报道了具有庞大亲水基团的表面活性剂仍位于脂质层的一侧，而有小亲水基团的表面活性剂则能穿透过脂质层，他们还描述了当表面活性剂浓度加大时，有庞大亲水基团的表面活性剂能与脂质膜上的磷脂形成胶质粒子，溶解了脂质，据此推理，非离子表面活性剂以相同机制溶解红细
8、胞膜.,石油烃类的微生物降解途径,微生物对石油的降解作用存在选择性,优先消耗碳链长度中等(C10C24)的n-链烷烃类分子，其规律为:小于C10的直链烷烃C10C24或更长的直链烷烃单环芳烃环烷烃多环芳烃,同种类型的烃类中分子量越大,降解越慢,通常认为饱和烃在微生物作用下，直链烷烃首先被氧化成醇，醇在脱氢酶的作用下被氧化为相应的醛，然后通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸；在转化为相应的脂肪酸后，一种转化形式为直接经历随后的-氧化序列，即形成羧基并脱落 2 个碳原子；另一种转化形式为脂肪酸先经历-羟基化形成-羟基脂肪酸，然后在非专一羟基酶的参与下被氧化为二羧基酸，最后再经历-氧化序列。脂肪酸通过-氧
9、化降解成乙酰辅酶A，后者进入三羧酸循环，分解成 CO2 和 H2O 并释放出能量，或进入其他生化过程。,脂肪酸氧化，分为活化，转移，-氧化共三个阶段1.脂肪酸的活化 和葡萄糖一样，脂肪酸参加代谢前也先要活化。其活化形式是硫酯脂肪酰CoA，催化脂肪酸活化的酶是脂酰CoA合成酶。活化后生成的脂酰CoA极性增强，易溶于水；分子中有高能键、性质活泼；是酶的特异底物，与酶的亲和力大，因此更容易参加反应。脂酰CoA合成酶又称硫激酶，分布在胞浆中、线粒体膜和内质网膜上。胞浆中的硫激酶催化中短链脂肪酸活化；内质网膜上的酶活化长链脂肪酸，生成脂酰CoA，然后进入内质网用于甘油三酯合成；而线粒体膜上的酶活化的长链
10、脂酰CoA，进入线粒体进入-氧化,2.脂酰CoA进入线粒体 催化脂肪酸-氧化的酶系在线粒体基质中，但长链脂酰CoA不能自由通过线粒体内膜，要进入线粒体基质就需要载体转运，这一载体就是肉毒碱，即3-羟-4-三甲氨基丁酸。,长链脂肪酰CoA和肉毒碱反应，生成辅酶A和脂酰肉毒碱，脂肪酰基与肉毒碱的3-羟基通过酯键相连接。催化此反应的酶为肉毒碱脂酰转移酶。线粒体内膜的内外两侧均有此酶，系同工酶，分别称为肉毒碱脂酰转移酶I和肉毒碱脂酰转移酶。酶使胞浆的脂酰CoA转化为辅酶A和脂肪酰肉毒碱，后者进入线粒体内膜。位于线粒体内膜内侧的酶又使脂肪酰肉毒碱转化成肉毒碱和脂酰CoA，肉毒碱重新发挥其载体功能，脂酰C
11、oA则进入线粒体基质，成为脂肪酸-氧化酶系的底物。,3.-氧化的反应过程 脂酰CoA在线粒体基质中进入氧化要经过四步反应，即脱氢、加水、再脱氢和硫解，生成一分子乙酰CoA和一个少两个碳的新的脂酰CoA。第一步脱氢(dehydrogenation)反应由脂酰CoA脱氢酶活化，辅基为FAD，脂酰CoA在和碳原子上各脱去一个氢原子生成具有反式双键的,-烯脂肪酰辅酶A。第二步加水（hydration)反应由烯酰CoA水合酶催化，生成具有L-构型的-羟脂酰CoA。,第三步脱氢反应是在羟脂肪酰CoA脱饴酶（辅酶为NAD+）催化下，-羟脂肪酰CoA脱氢生成酮脂酰CoA。第四步硫解（thiolysis)反应由
12、酮硫解酶催化，-酮酯酰CoA在和碳原子之间断链，加上一分子辅酶A生成乙酰CoA和一个少两个碳原子的脂酰CoA。,如果是奇数脂肪酸，最后会得到丙酰CoA。有两种代谢途径：一种是转化为琥珀酰CoA进入TCR。一种是转化为乙酰CoA进入TCR。第二种途径在微生物中较为普遍。此外，脂肪酸还具有-氧化途径和-氧化途径。,-氧化，脂肪酸在微粒体中由加单氧酶和脱羧酶催化生成-羟脂肪酸或少一个碳原子的脂肪酸,-氧化涉及末端甲基羟基化，生成一级醇，并继而氧化成醛，再氧化成羧酸。首先是脂肪酸的碳原子羟化生成-羧脂肪酸，再经醛脂肪酸生成,-二羧酸，然后在-端或-端活化，进入线粒体进入-氧化，最后生成琥珀酰CoA。,
13、微生物对支链烷烃的降解机理基本上与直链烷烃一致。相对于正构烷烃，支链的存在会增加微生物氧化降解的阻力，主要氧化分解的部位是在直链上发生的，而且靠近侧链的一端较难发生氧化反应。带支链烷烃的降解可以通过-氧化、-氧化或-碱基去除途径进行。总的说来，含有支链结构的烃类降解速度慢于相同碳数的直链烃类，这是因为烷烃的支链降低了分解速率,环烷烃在石油馏份中占有较大比例，首先经混合功能的氧化酶(羟化酶)氧化产生环烷醇，然后脱氢得酮，进一步氧化得到酯，或直接开环生成脂肪酸。真菌和细菌降解石油烃类化合物可形成具有不同的立体化学构型的中间产物。真菌将石油烃类化合物降解成反式二醇，而细菌几乎总是将之降解成顺式二醇,
14、在环烷烃中又以环己烷和环戊烷为主，没有末端烷基环烷烃，它的生物降解原理和链烷烃的次末端氧化相似。首先混合功能氧化酶（羟化酶）氧化产生环烷醇，然后脱氢得酮，进一步氧化得内酯，或直接开环，生成脂肪酸。以环已烷为例，其生物降解的机制为：混合功能氧化酶的羟化作用生成环已醇，后者脱氢生成酮，再进一步氧化，一个氧插入环而生成内酯，内酯开环，一端的羟基被氧化成醛基，再氧化成羧基，生成的二羧酸通过-氧化进一步代谢。,对于存在烷基取代环烷烃的微生物降解，其生物降解的途径与无取代基的环烷烃相同，当环被打开后，再以支链脂肪酸方式进行分解。,绝大多数研究表明，能够氧化环烷烃的微生物，并不能在环烷烃上生长，常见的是能转
15、化环已烷为环已酮的微生物不能内酯化和开环，而能将环已酮内酯化和开环的微生物却不能转化环已烷为环已酮。要使环己烷彻底矿化，还需要多个微生物和多个酶系统参与。已有实验证实，环烷烃是通过共代谢作用得到降解，当环己烷分别与丙烷与庚烷进行混合培养时，牡牛分枝杆菌和假单胞菌都能利用环已烷生成环已醇、环己酮和脂肪酸。而这两种细菌均不能单独利用环己烷作为唯一碳源和能源 进一步研究发现，细菌羟化环烷烃的能力显然在自然界广泛存在，这是由于单加氧酶的广泛特异性造成的。利用其它烃类的微生物细胞产生的单加氧酶(羟化酶)能够使环烷烃转化为环烷酮，由于这一现象广泛存在，因此未能进化出由环烷烃诱导的具加氧酶的微生物。可见微生
16、物之间的互生关系和共代谢在环烷烃的生物降解中起着重要作用。,现已在细菌、真菌和藻类中发现可降解多环芳烃的微生物。真菌产生的过氧化物酶能将多环芳烃降解为醌的衍生物。细菌可通过多种代谢方式对多环芳烃进行降解,以多环芳烃作为碳源,将其转化为二氧化碳和水;也可通过共代谢作用,对其进行降解,影响微生物降解石油污染物的因素,微生物在降解石油污染物的过程会受到营养元素、表面活性剂、O2通量、温度、pH值等外界因素的影响。其中,营养元素对降解率的影响较大，尤其是N、P元素。经专门对石油烃微生物降解的营养平衡进行了研究，表明氮、磷营养物质的缺乏直接限制了石油烃的微生物降解,但添加过量反而有抑制作用,表面活性剂是
17、影响降解效率的又一重要因素。表面活性剂对石油烃具有一定的增溶和分散作用，从而对石油降解菌的降解效率有重要作用，而有研究则指出表面活性剂对微生物存在一定毒害作用 表面活性剂的加量多少对石油烃降解菌的影响比较复杂：加少量的表面活性剂会促进石油烃降解菌的生长，但随着表面活性剂加量的增加,菌量反而减少,石油污染危害,土壤石油污染来源,溢油和泄漏；污水灌溉；油页岩矿渣堆放；大气沉降；药剂等的施用；油田化工集输系统油泥、碱渣油泥等；钢厂热轧、冷轧用油污染；修船、造船重油污染；。,石油污染生物修复方案,第一步：BDB-n生物降解菌（non aerobic bio-degradationbacterial）第二步BDB-a生物降解菌（aerobic bio-degradationbacterial）第三步植物修复,BDB-n修复,BDB-a修复,植物修复,案例介绍,石油污染土壤生物修复前、后照片,南洋东华生物,南洋东华生物,案例介绍,含油污泥经生物修复后种植的草坪和草种,南洋东华生物,南洋东华生物,联系人/Contact:翟一波/Popo手机网站邮箱地址/Address：北京市朝阳区芍药居乙二号/Yi floor2,Shaoyaoju,Chaoyang District,Beijing,China 邮编/Postcode:100026,谢谢大家,
