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1、第23章 柠檬酸循环,主要内容,TCA准备阶段TCA循环阶段TCA产能计算TCA的调节TCA双重作用,TCA背景知识,1、为什么称为柠檬酸循环、三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle,TCA）、Krebs循环？在有氧的情况下，葡萄糖酵解产生的丙酮酸氧化脱羧形成乙酰CoA。乙酰CoA经一系列氧化、脱羧，最终生成C2O和H2O并产生能量的过程，称为柠檬酸循环，亦称为三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle),简称TCA循环。由于它是由（德国）正式提出的，所以又称Krebs循环。,“It is convenient to use a brief term f
2、or the kind of scheme.Its essential feature is the periodic formation of a number of di-and tricarboxylic acids.As there is no term which would serve as a common denominator for all the various acids,it seemed reasonable to name the cycle,after one,or some,of its characteristic and specific acids.It
3、 was from such considerations that the term citric acid cycle was proposed in 1937.”（Hans A.Krebs,The citric acid cycle,Nobel Lecture,December 11,1953）,Krebs,1901-1981,Brief history of TCA,The first major investigation into the intermediary metabolism of oxidation was that of Thunberg,who examined s
4、ystematically the oxidizability of organic substances in isolated animal tissues.Between 1906 and 1920 he tested the oxidation of over 60 organic substances,chiefly in muscle tissue.He discovered the rapid oxidation of the salts of a number of acids,such as lactate(乳酸盐),succinate(琥珀酸盐),fumarate(延胡索酸
5、盐),malate(苹果酸盐),citrate(柠檬酸盐),and glutamate(谷氨酸盐).,In 1932,Krebs was studying the rates of oxidation of small organic acids by kidney and liver tissue.Only a few of substances were active in these experiments-notably succinate,fumarate,acetate,malate,and citrate.,An important development came from t
6、he laboratory of Szent-Gyorgyi of Szegedin 1935,who confirmed on pigeon breast muscle the rapid oxidation of the C4-dicarboxylic acids-succinic,fumaric,malic,and oxaloacetic acids-and arrived at the new conclusion that those dicarboxylic acids were linked by an enzymatic pathway that was important f
7、or aerobic metabolism.,A decisive contribution to the field was made in March 1937 by Martius and Knoop,who discovered-ketoglutarate(-酮戊二酸)as a product of citrate oxidation.Because it was already known that-ketoglutarate could be enzymatically oxidized to succinate,the pathway from citrate to oxaloa
8、cetate was seemed as:,In 1937,Krebs found that citrate could be formed in muscle suspensions if oxaloacetate and either pyruvate or acetate were added.Now,he get a cycle:,TCA背景知识,2、细胞呼吸（cell respiration）要经历三个阶段：糖酵解阶段、柠檬酸循环阶段、氧化磷酸化阶段。3、糖酵解的产物丙酮酸进入TCA之前有一准备过程，即形成乙酰CoA。,TCA准备阶段,丙酮酸在丙酮酸脱氢酶系催化下氧化脱羧形成乙酰辅酶
9、A。,丙酮酸脱氢酶系复合物含三种酶和五个辅助因子,E1:pyruvate dehydrogenase,thiamine pyrophosphate(TPP)E2:dihydrolipoyl transacetylase,lipoic acid,coenzyme A-SH E3:dihydrolipoyl dehydrogenase,NAD+,FAD,IRREVERSIBLE,TCA准备阶段,H+,丙酮酸脱氢酶系作用机理（1）,1.丙酮酸与TPP结合并 脱羧形成羟乙基TPP。2.羟乙基TPP氧化转变成 乙酰基同时转移到E2的 辅基硫辛酰胺上。3.在E2上的乙酰基在E2 催化下转移到CoASH 上
10、形成游离的乙酰CoA.从而形成了一个高能硫 酯键。,The mechanistic details of the first three steps of the pyruvate dehydrogenase complex reaction,TCA准备阶段,TCA准备阶段,丙酮酸脱氢酶系作用机理（2）,4.还原型的E2将二个SH基H 转移到E3的辅酶FAD上形 成还原型FADH,5.E3上的还原型的FADH将 H交给NAD+形成NADH，E3辅基又形成氧化型的 FAD,TCA准备阶段,丙酮酸脱氢酶系反应图解,E1,E3,TCA准备阶段,砷化物对硫辛酰胺的毒害作用 有机砷化物和亚砷酸能与丙酮酸
11、脱氢酶系中的E2辅基硫辛酰胺共价结合，使还原型的硫辛酰胺形成失去催化能力的砷化物。这类砷化物同样表现在对酮戌二酸脱氢酶系的抑制上。,TCA概貌,2C,6C柠檬酸,6C异柠檬酸,5C 酮戌二酸,4C琥珀酰CoA,4C琥珀酸,4C延胡索酸,4C苹果酸,4C草酰乙酸,1、草酰乙酸与乙酰辅酶A形成柠檬酸催化此反应的酶为柠檬酸合酶；反应的中间产物为柠檬酰辅酶A；柠檬酸合酶属于调控酶，其活性受ATP、NADH、琥珀酰CoA、酯酰CoA等的抑制；另一种抑制剂是丙酮酰CoA。它是TCA循环的限速酶，由氟乙酸形成的氟乙酰CoA可被该酶催化形成氟柠檬酸，从而抑制下一步的顺乌头酸酶催化的反应。此称为致死性合成反应。
12、,TCA循环阶段,S-CoAintermediate,哺乳动物体内柠檬酸合成酶以二聚体形式存在。与草酰乙酸的结合使酶发生有利于和乙酰CoA结合的形变。,TCA循环阶段,柠檬酸合成酶的单聚体形式，绿色原子为柠檬酸，粉色原子为CoA,TCA循环阶段,草酰乙酸与乙酰辅酶A形成柠檬酸，反应的中间产物为柠檬酰辅酶A。,、柠檬酸异构形成异柠檬酸催化此反应的酶为乌头酸酶；反应的中间产物为顺乌头酸；反应为先脱水后水化；由于反应生成的异柠檬酸在下一步反应中迅速被氧化而使反应向生成异柠檬酸的方向进行。,TCA循环阶段,顺乌头酸酶催化柠檬酸异构化为柠檬酸，反应分两步进行，经历一个顺乌头酸中间体。反应具有严格的空间特
13、异性。,TCA循环阶段,顺乌头酸酶活性位点的铁硫聚簇。,TCA循环阶段,氟乙酸到氟柠檬酸的转化,TCA循环阶段,、异柠檬酸氧化生成酮戌二酸催化此反应的酶为异柠檬酸脱氢酶；反应为TCA二次氧化脱羧中的第一个反应；反应中间产物为不稳定的草酰琥珀酸；既有以NAD+为辅酶的异柠檬酸脱氢酶，也有以NADP+为辅酶的异柠檬酸脱氢酶。异柠檬酸脱氢酶是变构调节酶，其活性受ADP和NAD+的变构激活，受ATP和NADH的变构抑制。,TCA循环阶段,-脱羧反应,TCA循环阶段,4、酮戌二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA催化此反应的酶为酮戌二酸脱氢酶复合体，该酶由酮戌二酸脱氢酶E1、二氢硫辛酰转琥珀酰酶E2和二氢硫辛酰脱
14、氢酶E3及六种辅助因子TPP、硫辛酸、CoA、NAD+、FAD、Mg2+组成；反应为TCA二次氧化脱羧中的第二个反应；反应释放的能量主要存于琥珀酰CoA的高能硫酯键中；,TCA循环阶段,4、酮戌二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA 酮戌二酸脱氢酶是变构调节酶，其活性受产物琥珀酰CoA、NADH和高能ATP的变构抑制。与丙酮酸脱氢酶复合体中E1不同的是该酶不受磷酸化与去磷酸化的共价修饰调节作用；,TCA循环阶段,5、琥珀酰CoA转化为琥珀酸并释放高能磷酸键催化此反应的酶为琥珀酰CoA合成酶或称琥珀酰硫激酶；该反应为TCA是唯一直接产生高能磷酸键的步骤，也是一步底物水平磷酸化产生能量的步骤；反应生产的GT
15、P在蛋白质的生物合成中起磷酰基供体及激活信号蛋白的作用，也可以与ADP磷酸化生成ATP相偶联产生能量。,TCA循环阶段,琥珀酰CoA合成酶反应机制,TCA循环阶段,6、琥珀酸脱氢生成延胡索酸催化此反应的酶为琥珀脱氢酶；它以FAD为辅基；该酶具有严格的立体专一性，即只生成反式延胡索酸；与琥珀酸结构类似的化合物如丙二酸、戌二酸等是该酶的竞争性抑制剂。,TCA循环阶段,TCA循环阶段,琥珀酸脱氢酶的铁硫聚簇,FAD和琥珀酸脱氢酶的共价结合,7、延胡索酸水合成L-苹果酸催化此反应的酶为延胡索酸酶；该酶具有严格的立体专一性，即只生成L-苹果酸；,TCA循环阶段,TCA循环阶段,延胡羧酸酶的两种可能的反应
16、机制,8、L-苹果酸脱氢生成草酰乙酸催化此反应的酶为苹果酸脱氢酶；该酶的辅基为NAD+；由于草酰乙酸与乙酰CoA合成柠檬酸的反应是高度放能反应，因此通过草酰乙酸的不断消耗来驱使该反应不断向生成草酰乙酸方向进行。,TCA循环阶段,TCA循环阶段,以NAD+作为辅酶的脱氢酶的空间特异性比较,TCA循环阶段,苹果酸脱氢酶的结构,TCA循环阶段,TCA Cycle,乙酰草酰成柠檬，柠檬易成-酮琥酰琥酸延胡索，苹果落在草丛中。,1、总反应离开循环的二分子CO2的碳并非来自进入循环的乙酰辅酶A，而分别来自异柠檬酸脱羧和-酮戌二酸脱羧反应；每循环一次共产生一个GTP、消耗二个水分子；每一次循环有4次氧化反应
17、，共产生3分子NADH和1分子FADH2；每次循环产生的能量：1（GTP）+32.5(NADH)+1 1.5(FADH2)=10 ATP若从丙酮酸算起则产生：10+2.5(NADH)=12.5 ATP若从葡萄糖算起则产生：12.5 2+2+2(NADH)2.5=32ATP,TCA能量计算,Acetyl CoA+3 NAD+FAD+GDP+Pi+2 H2O,2 CO2+3 NADH+FADH2+GTP+2 H+CoA,TCA中C的归宿,TCA中C的归宿,TCA的调控可看成来自二方面：TCA循环本身所具有的内部相互制约系统的调控和ADP、ATP、Ca2+对循环的调控。1、调控丙酮酸脱氢酶复合体,T
18、CA的调控,TCA的调控是通过循环的别构效应剂和共价修饰实现的。1、调控丙酮酸脱氢酶复合体,TCA的调控,丙酮酸脱氢酶复合体的调控1.1.产物调控 即由NADH和乙酰CoA控制。这二种物质是和酶的作用底物NAD+和CoA竞争酶活性部位。乙酰CoA抑制E2、NADH抑制E3。1.2.磷酸化和去磷酸化的调控 E2上结合有二种酶：激酶和磷酸化酶。激酶使丙酮酸脱氢酶组分磷酸化而失活，磷酸酶则脱去丙酮酸脱氢酶上的磷酸基团而活化。Ca2+可使磷酸酶活化从而激活丙酮酸脱氢酶。,TCA的调控,2、调控TCA循环的三个限速反应3、ATP、ADP和Ca2+对TCA的调控,TCA的调控,TCA的中间产物为许多生成合
19、成提供前体物质。,TCA的双重作用,OXALOACETATEREPLENISHED BYPYRUVATECARBOXYLASE,丙酮酸羧化酶催化由丙酮酸羧化生成草酰乙酸的反应是哺乳动物中最主要的回补反应（anaplerotic reaction）。许多植物和某些微生物是通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase）催化的反应向柠檬酸循环提供草酰乙酸的。,TCA的双重作用,Substrate Channeling through Multienzyme Complexes May Occur in the Citric Acid Cycle,Alth
20、ough the enzymes of the citric acid cycle are usually described as soluble components of the mitochondrial matrix(except for succinate dehydrogenase,which is membrane-bound),growing evidence suggests that within the mitochondrion these enzymes exist as multienzyme complexes.,Deeper Look-,in cells,mu
21、ltienzyme complexes ensure efficient passage of the product of one enzyme reaction to the next enzyme in the pathway.Such complexes are called metabolons（代谢区室）.,question,丙二酸是琥珀酸脱氢酶催化反应的的一种竞争性抑制剂。解释为什么增高草酰乙酸的浓度能够克服丙二酸的抑制作用。假定这一反应发生在肝脏制剂中。丙氨酸降解产生丙酮酸，亮氨酸降解产生乙酰CoA。这两种氨基酸的降解能为柠檬酸循环的中间物库作出补充吗？储存在动物脂肪组织的三酰
22、甘油是能量的重要来源。脂肪酸降解产生乙酰CoA，后者能激活丙酮酸羧化酶。该酶的激活为什么会有助于从脂肪酸获得能量？丙酮酸氧化脱羧反应的最后两步反应并不涉及丙酮酸分子中的任何一个碳原子，但是这两步反应仍然是丙酮酸脱氢酶复合物催化活性所必需的。为什么?,Answer,通过加入更多的底物（在该反应中，底物是琥珀酸）可以克服竞争性抑制作用。草酰乙酸之所以能克服丙二酸的抑制作用，是因为它能通过柠檬酸循环转变成琥珀酸。丙氨酸降解产生的丙酮酸可以在丙酮酸羧化酶的催化下转变成柠檬酸循环的中间物草酰乙酸。这是哺乳动物的一条主要的回补途径。亮氨酸降解产生的乙酰CoA只能进入柠檬酸循环被降解掉，不能为该循环补充代谢中间物。由于乙酰CoA能激活丙酮酸羧化酶，因而它促进了草酰乙酸直接从丙酮酸产生。于是会有更多的草酰乙酸与脂肪酸降解产生的乙酰CoA缩合，生成柠檬酸。其结果是加快了乙酰CoA经柠檬酸循环被氧化和能量转化的速度，导致更多的ATP由脂肪酸降解产生。,在丙酮酸脱氢酶复合物催化的反应中，氧化型的硫辛酸接受来自焦磷酸硫胺素的一个乙酰基，并被还原为二氢硫辛酸。由于硫辛酸在下次循环中被重新利用，因此它必须重新被氧化。二氢硫辛酸的氧化是由二氢硫辛酸脱氢酶的辅基FAD完成的，而FAD在下次循环中也被利用，它也必须重新被氧化，使NAD+还原为NADH。,
