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1、肿瘤与新生淋巴管,2009-10-8,2023/10/18,2,前 言,恶性肿瘤常见的转移方式,淋巴道转移,血行转移,直接蔓延,2023/10/18,3,前 言,淋巴道转移是肿瘤细胞扩散的早期特征之一,是临床分期的评价标准,临床和病理资料显示,在许多肿瘤中,肿瘤细胞通过淋巴管转移是最常见的通道,结直肠癌约50%经淋巴道转移。近年由于淋巴管内皮细胞特异性标志物的出现,肿瘤淋巴管生成与淋巴道转移关系的研究成为肿瘤转移机制的热点。,2023/10/18,4,主 要 内 容,肿瘤淋巴管特点,淋巴管标记物研究进展,淋巴管生成的分子调节机制,抗肿瘤淋巴管生成的治疗,5,2,3,4,1,淋巴系统的结构和功能
2、,2023/10/18,5,T细胞B细胞NK细胞,脾胸腺骨髓,壁薄压力低,沿淋巴管全程分布,淋巴管,集合性淋巴组织,淋巴结,淋巴细胞,淋巴系统,1.1 淋巴系统的结构特征,2023/10/18,6,1.1 淋巴系统的结构特征,淋巴管与血管超微结构及功能区别毛细淋巴管是盲端的管道,由一层薄壁,无孔的淋巴内皮细胞构成淋巴管内皮细胞比血管内皮细胞有较少紧密连接,从而渗透性较强毛细淋巴管基底膜不完整,而且缺乏相应的外膜细胞和平滑肌细胞覆盖它们的管腔比血管的管腔宽大,形状更不规则大的收集淋巴管有平滑肌细胞,能够通过收缩使淋巴液在管道中推进 淋巴管通过锚丝与细胞外胶质相连接 毛细淋巴管的这些结构特征为肿瘤
3、淋巴道转移提供了比血管转移更有利的转移通道。,通过锚丝的牵拉，使毛细淋巴管扩张，导致相邻的毛细淋巴管内皮细胞间连接开放，形成内皮细胞间通道。,2023/10/18,7,1.1 淋巴系统的结构特征,Pepper等认为与血管相比,淋巴管管腔更大,淋巴液流速低,且和组织液等同,通过淋巴管转移更有利于肿瘤细胞的存活和转移的形成,2023/10/18,8,1.2 淋巴系统的功能,2023/10/18,9,1.2 淋巴系统的功能,淋巴流入血液循环系统的生理意义,回收蛋白质,运输脂肪和其他营养物质,防御作用,调节血浆和组织间液的液体平衡,1,2,4,3,组织间液中的蛋白质分子不能通过毛细血管壁进入血液，但比
4、较容易透过毛细淋巴管壁而形成淋巴的组成部分。每天约有75200克蛋白质由淋巴带回血液，使组织间液中蛋白质浓度保持在较低水平,由肠道吸收的脂肪8090是由小肠绒毛的毛细淋巴管吸收,每天生成的淋巴约24升回到血浆，大致相当于全身的血浆量,淋巴流动还可以清除因受伤出血而进入组织的红细胞和侵入机体的细菌，对动物机体起着防御作用,2023/10/18,10,主 要 内 容,肿瘤淋巴管特点,淋巴管标记物研究进展,淋巴管生成的分子调节机制,抗肿瘤淋巴管生成的治疗,5,2,3,4,1,淋巴系统的结构和功能,2023/10/18,11,2.1淋巴管在肿瘤组织中的分布,以往的研究认为肿瘤外周存在增多、扩张的淋巴管
5、，肿瘤内部无淋巴管。最近有研究表明在小肠恶性肿瘤、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、膀胱癌的癌组织内存在微淋巴管、新生淋巴管或淋巴样迷路,只是部分处于萎陷状态。研究表明，较高的淋巴管密度可能是一个预后不良的重要指标。,2023/10/18,12,2.1淋巴管在肿瘤组织中的分布,功能性淋巴管,无功能淋巴管,扩张或极度扩张,多呈闭索状,大多开放,很少开放,多,少,数量,管腔,形态,功能,区别,肿瘤周边的淋巴管,肿瘤内部的淋巴管,2023/10/18,13,2.1淋巴管在肿瘤组织中的分布,肿瘤内部之所以存在无功能性的淋巴管,可能与下列因素有关:肿瘤内部缺乏原始瓣膜结构的淋巴管,阻止、抑制了组织液的摄
6、入及淋巴管功能不断生长的肿瘤细胞产生机械力,使淋巴管萎缩、无功能肿瘤细胞侵袭、破坏淋巴管网,从而只在肿瘤内部留下淋巴管上皮残迹。,2023/10/18,14,主 要 内 容,肿瘤淋巴管特点,淋巴管标记物研究进展,淋巴管生成的分子调节机制,抗肿瘤淋巴管生成的治疗,5,2,3,4,1,淋巴系统的结构和功能,2023/10/18,15,3淋巴管标志物研究进展,与血行转移相比,对淋巴管生成和转移知之甚少,主要原因是缺乏特异的淋巴管标志物。近年由于淋巴管内皮细胞特异性标志物的出现,才使得肿瘤淋巴管生成与淋巴道转移关系的研究成为肿瘤转移机制的热点。,2023/10/18,16,3.1淋巴系统的研究方法进展
7、,淋巴管注射研究方法动脉内墨汁-硝酸银溶液注射法酶组织化学染色方法免疫组织化学方法电镜技术放射性核素示踪技术淋巴造影新生淋巴管研究,2023/10/18,17,3.2理想淋巴管标志物特点,在淋巴管内皮细胞特异性地表达（阳性标志物）或不表达（阴性标志物），而不是依赖于其在淋巴管和血管的表达量差异表达或不表达于各级淋巴管内皮细胞表达特异性在病理状态下不会发生改变在组织学水平易于检测，且在标本处理过程中较为稳定利用该标志物在电镜水平也能可靠地将两种脉管加以区分,迄今为止，完全符合以上标准的淋巴管标志物不存在，但一些相对特异性的标志物已应用于淋巴管生物学及肿瘤淋巴管生物学的研究中。,2023/10/1
8、8,18,3.3淋巴管内皮特异性标记物,1 血管内皮生长因子受体-3VEGFR-3 VEGFR-3又称FLT4，是第一个被发现的淋巴管内皮标记物,是一种酪氨酸激酶受体，VEGFR-3为VEGF-C和VEGF-D的特异性受体,也是淋巴管生成的重要调节因子。目前认为，虽然多数情况下VEGFR-3特异性地表达于淋巴管内皮细胞，但因其在肿瘤组织中尚表达于新生的毛细血管，故不适宜单独作为淋巴管标志物用于肿瘤淋巴管生成的研究。,2023/10/18,19,3.3淋巴管内皮特异性标记物,2 淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1LYVE-1 LYVE-1与CD44具有同源性,是CD44糖蛋白的同系化合物,是透明质酸
9、(HA)的一个主要受体,均匀分布于淋巴管腔面和基底面,起到从组织摄取透明质酸盐并转运至淋巴液的作用。当肿瘤组织HA数量增加时,LYVE-1水平增高,患者预后不良。提示LYVE-1与肿瘤的浸润和转移有关。因LYVE-1除分布于淋巴内皮细胞外,还表达于正常肝血管窦的内皮细胞。因此,用LYVE-1作为淋巴管的特异标志物还有争议。,2023/10/18,20,3.3淋巴管内皮特异性标记物,肾小球足突细胞膜蛋白Podoplanin,Podoplanin也称为E抗原，先前认为它只表达于小淋巴管内皮,目前研究显示皮肤某些血管内皮细胞也可表达podoplanin,但其他器官和组织的血管内皮未发现其表达,因此认
10、为该蛋白是目前较理想的淋巴管标志物。,2023/10/18,21,3.3淋巴管内皮特异性标记物,4 同源转录因子、淋巴管内皮细胞标志物同源盒基因Prox-1 Prox-1是从黑腹果蝇Prospero基因中克隆出的同源基因,它是一种转录因子,可能调控着淋巴内皮细胞的分化或迁移,在胚胎淋巴管发育中具有重要作用。Prox-1在原始静脉内皮细胞的差异性表达与分化方向有关,表达Prox-1的原始静脉向淋巴管方向分化,而不表达Prox-1的原始静脉向血管方向分化。,2023/10/18,22,3.3淋巴管内皮特异性标记物,4 同源转录因子、淋巴管内皮细胞标志物同源盒基因Prox-1 Prox-1可在一些非
11、上皮细胞中出现，所以须与其他淋巴管上皮细胞的胞质或胞膜标记物联合使用,才可确定淋巴管的特异性。移除prox-1基因后,胚胎发育时原始静脉内皮细胞生成淋巴管过程被阻断,表明prox-1是淋巴管生成最基本的调控因子。,2023/10/18,23,3.3淋巴管内皮特异性标记物,5 桥粒相关转膜糖蛋白 Desmoplakin,Desmoplakin是一种表达于细胞间连接处的桥粒蛋白,属于细胞骨架连接蛋白的血小板容素家族成员，它只表达于淋巴管内皮细胞而不表达于血管内皮细胞,是一种新的淋巴管内皮标志物。,2023/10/18,24,3.3淋巴管内皮特异性标记物,6 单克隆抗体D2-40 D2-40是一种能
12、与M2A特异性结合的单克隆抗体。D2-40不同于其它的内皮特异性标记物,如CD31、CD34和FLI-1等基因产物既表达于淋巴管又表达于血管,而这个抗体只识别淋巴内皮细胞不识别血管内皮细胞。D2-40表达的阳性程度与微淋巴管密度(MLVD)呈正相关,而MLVD和淋巴结的转移又是肿瘤分期分级的重要指标,所以D2-40的标记对判断肿瘤恶性程度有一定的临床意义。,M2A抗原是一种与生殖细胞肿瘤相关的癌胚抗原，该抗原最初在生殖细胞肿瘤和胚胎睾丸的精母细胞表面发现,是一个分子量为40 000 kD的唾液酸糖蛋白,2023/10/18,25,3.3淋巴管内皮特异性标记物,7 其他淋巴内皮标志物 包括5-核
13、苷酸酶、巨噬细胞甘露糖受体、次级淋巴组织趋化因子D6以及-趋化因子受体等。目前对上述标志物尚缺乏严格的对比研究,其是否可作为淋巴管内皮细胞特异性标志物还有待进一步研究。,2023/10/18,26,3.3淋巴管内皮特异性标记物,2023/10/18,27,主 要 内 容,肿瘤淋巴管特点,淋巴管标记物研究进展,淋巴管生成的分子调节机制,抗肿瘤淋巴管生成的治疗,5,2,3,4,1,淋巴系统的结构和功能,2023/10/18,28,4.1 VEGF家族,血管内皮生长因子家族(vascular endothelial growth factor family，VEGFs)包括VEGF-A、VEGF-B
14、、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及血小板生长因子(placenta growth factor，PIGF)，它们具有相似的氨基酸序列，但各自的调节机制、表达模式以及结合的受体却有很大不同VEGF家族调控着血管生成、淋巴管生成、血管通透性及内皮细胞存活,2023/10/18,29,4.1 VEGF家族,2023/10/18,30,4.1.1 VEGF-C/D,VEGF-C/D的结构特点 VEGF-C和VEGF-D是首先被确认能在体内介导新生淋巴管生长的生长因子。VEGF-C也称血管内皮生长因子相关蛋白(VRP)，是高度保守的分泌性糖蛋白，也是首先发现能与VEGFR-3结合的配体。它可与
15、VEGF-D构成亚群，以前体蛋白原的形式分泌，成熟的VEGF-C的结构中包含信号序列、N-和C-末端以及VEGF同源域(VEGF homology domain，VHD)。,2023/10/18,31,4.1.1 VEGF-C/D,VEGF-C/D的结构特点 VEGF-D，也称c-fos介导的生长因子(c-fos-in-dued growth factor，FIGF)，它与VEGF-C有61%的序列相同，也含有VEGF家族所特有的8个保守的半胱氨酸残基以及富含半胱氨酸的COOH端，两者在人类内皮细胞上结合相同的受体。VEGF-D的蛋白水解过程与VEGF-C相似，蛋白水解的过程也可调节其生物学活
16、性和受体特异性，在淋巴管生成中发挥作用。但VEGF-D在鼠类仅与VEGFR-3结合，表明VEGF-D在鼠类和人类中可能有不同的功能，这是与其它VEGF家族成员不同之处。,2023/10/18,32,4.1.1 VEGF-C/D,VEGF-C/D促淋巴管生成的作用机制,4,形成VEGF-C/D-VEGFR-3信号通道,1,肿瘤细胞分泌出VEGF-C/D无活性的前蛋白,3,被激活的VEGF-C/D蛋白与特异性表达于淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR-3结合,2,此蛋白通过丝氨酸蛋白纤溶酶等蛋白酶水解作用去掉C端和N端后形成VEGF-C/D的活性形式,2023/10/18,33,4.1.1 VEGF-
17、C/D,VEGF-C/D促淋巴管生成的作用机制VEGF-C/D-VEGFR-3信号通道路可能通过以下转导途径发挥作用,即VEGF相关蛋白与VEGFR-3L结合后导致VEGFR-3L磷酸化并激活结联蛋白,使后者的SH2区与PTB区结合而发生自身磷酸化。磷酸化的结联蛋白可与调节蛋白Grb2的SH2区结合,并促进Grb2的SH2区与尿嘌呤核苷酸释放因子SOS结合形成复合体。此复合体激活Ras信号转导通路,并最终诱导细胞的有丝分裂途径。导致淋巴管生成、增生、扩张,从而促进恶性肿瘤细胞向区域淋巴结转移。肿瘤细胞分泌的VEGF-C和VEGF-D能够对肿瘤间质压产生重大影响，间质压的增高可能是肿瘤细胞侵入血
18、管和淋巴循环进行转移的一条重要途径。,2023/10/18,34,4.1.1 VEGF-C/D,VEGF-C/D与恶性肿瘤 在人类许多恶性肿瘤包括甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、子宫颈癌、前列腺癌、皮肤黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌等,肿瘤原发癌组织中VEGF-C/D的表达与区域淋巴结转移、某些肿瘤的标志物以及某些特定基因有一定关系。文献报道,VEGF-C在恶性肿瘤中的表达水平明显高于良性病变,其表达与一些特异性的肿瘤标志物如AFP、C-erbB-2、VEGF等也呈正相关。,2023/10/18,35,4.1.2 其他有关因子,Hsieh等对卵巢癌的研究发现,Her2/neu过表达与VEGF
19、-C、VEGF-D表达呈正相关。Yang等对乳腺癌的研究亦有相似结果。某些炎症因子,如IL-1、TNF-等也可显著上调VEGF-C的表达,间接促进淋巴管形成。Prox1-Wigle等发现敲除Prox1基因后,静脉内皮细胞无法向淋巴内皮细胞定向分化;胚胎发育时以出芽方式自静脉内皮细胞生成淋巴管的过程受阻;表明Prox1是淋巴管生成最基本的调控因子。Hong等采用基因转染等技术也证明,Prox1单一基因即可促成血管内皮细胞定向分化为淋巴管内皮细胞表型,并称其为淋巴管生成的“总开关”。,2023/10/18,36,4.1.2 其他有关因子,Tie2:是首先在血管内皮细胞上发现的一种酪氨酸激酶受体,以
20、血管生成素为配体,其主要功能是调控血管生成过程。Veikkola等认为,血管生成素Ang2可作用于淋巴管内皮细胞上的Tie2受体而促进淋巴管发展和维护其正常生理功能。NP2:即neuropilin2,是一种神经蛋白受体。NP2是以与VEGFR3形成二聚体的方式发挥其调控功能的。Yuan等研究表明,NP2是维持淋巴管正常形态结构及功能的重要因素。另外,还有Net、次级淋巴趋化因子(SLC/CCL21)等多种基因亦直接或间接参与淋巴管形成的调节。对于不同分子通道控制淋巴系统发生发展的因子正在进一步深入研究中。,2023/10/18,37,主 要 内 容,肿瘤淋巴管特点,淋巴管标记物研究进展,淋巴管
21、生成的分子调节机制,抗肿瘤淋巴管生成的治疗,5,2,3,4,1,淋巴系统的结构和功能,2023/10/18,38,5.1 研究现状,随着对肿瘤淋巴管生成的深入研究及其机制的逐渐明晰,抗肿瘤淋巴管生成将成为肿瘤治疗的一种新方法。肿瘤抗淋巴管治疗可分为2种途径:抑制肿瘤新生淋巴管及阻止已形成的肿瘤淋巴管。,2023/10/18,39,靶向肿瘤淋巴管生成,如使用中和性的抗VEGF-C/D、VEGFR-2/3抗体,或通过腺病毒或腺相关病毒表达可溶性的VEGFR-3片段,或借助小干扰RNA介导的基因沉默技术靶向VEGF-C/D和其受体,如靶向PDGF-BB、FGF、IGF等生长因子信号通路,如BAY 4
22、3-9006、CEP-7055和PTK787等,目前这些小分子抑制剂正处于临床试验阶段,阻断VEGF-C/D-VEGFR-3信号通路,靶向其他信号通路,VEGFR-2/3激酶活性的小分子抑制剂,靶向促炎细胞因子调节VEGF-C生成的信号通路,5.2靶向肿瘤淋巴管生成的策略,阻断VEGF-C/D-VEGFR-3信号通道可抑制肿瘤淋巴管生成及淋巴管转移的形成,2023/10/18,40,5.3阻断VEGF-C/D与VEGFR-3作用的方法,VEGF-C/D或VEGFR-3的功能阻断性抗体,可溶性VEGFR-3-Ig,小分子肽抑制剂,前蛋白转化酶抑制剂,基 因 治 疗,迄今研究较多的用于 阻断VEG
23、F-C或VEGF-D与VEGFR-3相互作用的主要方法,可特异性阻断VEGF-C或VEGF-D与其受体VEGFR-3的结合,使VEGFR-3不能被活化,故淋巴管增殖、迁移所需的信号无法进行传导,从而抑制淋巴管生成。,VEGFR-3-Ig虽然可与VEGF-C或VEGF-D结合，但无法进行下游的信号传导，从而达到抑制肿瘤淋巴管生成的作用。,通过反义技术或小分子RNA干扰技术抑制肿瘤细胞分泌VEGF-C/VEGF-D阻止肿瘤淋巴管的生成和转移。小分子RNA干扰技术是近年来发展起来的新技术，并作为一种新的工具用于肿瘤的治疗研究。,2023/10/18,41,5.4 中医药治疗,目的:观察收涩类中药对小
24、鼠H22腹水型肝癌细胞血道和淋巴 道转移的影响方法:取昆明种小鼠50只，随机分为5组，每组各10只，即阴性对照组、参一胶囊组、椿皮组、乌梅组和山茱萸组,采用腹水型肝癌H22瘤株，在小鼠右下肢爪垫内侧皮下注射接种，连续给药21d后，脱颈椎处死小鼠，观察小鼠实体瘤的瘤重量、抑瘤率、肺部转移率、淋巴结转移等相关指标的变化情况结果:乌梅组和山茱萸组的肺部转移结节较模型组明显减少，抑瘤率明显增加;椿皮、乌梅、山茱萸组的淋巴结转移显著减少。结论:收涩类中药对H22腹水型肝癌细胞血道及淋巴道两种转移途径均有一定的抑制作用。孙静.收涩类中药对小鼠肝癌血道及淋巴道转移的影响.中药新药与临床药理,2008,19(
25、5):347,收涩类中药对小鼠肝癌血道及淋巴道转移的影响,2023/10/18,42,5.4 中医药治疗,人参皂苷Rg3诱导淋巴管内皮细胞凋亡作用的研究,目的:探讨人参皂苷Rg3(20(R)-Ginsenoside Rg3)对淋巴管内皮细胞的抑制效应及凋亡诱导作用。方法:取健康猪的胸导管内皮细胞进行分离、培养;VIII因子对淋巴管内皮细胞进行鉴定。用含不同浓度人参皂苷Rg3处理淋巴管内皮细胞,采用MTT法检测药物对细胞的抑制作用,倒置显微镜观察细胞形态学改变;Hoechst33258荧光染色检测淋巴管内皮细胞凋亡。结果:经VIII因子对培养的淋巴管细胞进行鉴定,为典型淋巴管内皮细胞。随着药物浓
26、度的升高,作用时间的延长,人参皂苷Rg3对淋巴管内皮细胞的生长抑制率逐渐增高;在人参皂苷Rg3作用下,淋巴管内皮细胞呈凋亡改变,出现凋亡小体。结论:人参皂苷Rg3能诱导淋巴管内皮细胞凋亡,抑制淋巴管内皮细胞增殖。李晶波.人参皂苷Rg3诱导淋巴管内皮细胞凋亡作用的研究.中医药信息,2009,26(4):22.,2023/10/18,43,5.5 恩度与淋巴管生成,重组人血管内皮抑制素对淋巴管内皮细胞骨架及淋巴管生成的影响,目的:研究重组人血管内皮抑制素(Endostar,恩度)对淋巴管内皮细胞的作用及淋巴管生成的影响。方法:磁珠分选小儿包皮真皮淋巴管内皮细胞进行培养,并在光镜下观察和采用细胞特异
27、性标记物检测。设立对照组和恩度实验组,应用免疫荧光法和体外三维培养法来判定恩度对淋巴管内皮细胞有无抑制作用。欧娟娟.重组人血管内皮抑制素对淋巴管内皮细胞骨架及淋巴管生成的影响.临床肿瘤学杂志,2009,14(6):491.,2023/10/18,44,5.5 恩度与淋巴管生成,GI:分别为对照组、0.20mg/L恩度组、0.40mg/L恩度组淋巴管内皮细胞的细胞骨架微丝变化正常对照组:细胞膜及细胞内荧光均较强,可见明显的细胞内骨架分布,呈条索状。恩度处理组:细胞内荧光明显减少,细胞骨架特征性条索状分布消失,且细胞内荧光与胞膜荧光不连续。,2023/10/18,45,5.5 恩度与淋巴管生成,M
28、O:分别为对照组、0.20mg/L恩度组、0.40mg/L恩度组淋巴管内皮细胞成管能力变化正常对照组:淋巴管出芽丰富，管状结构较为明显恩度处理组:淋巴管出芽数量随药物浓度增高逐渐减少,管状结构不明显,2023/10/18,46,5.5 恩度与淋巴管生成,结果:恩度实验组淋巴管内皮细胞骨架中微丝排列极性减弱或消失,微管无明显改变。恩度实验组淋巴管内皮细胞体外形成管状分支数量及管状结构形成能力较对照组明显下降(P0.05)。结论:重组人血管内皮抑制素(恩度)对淋巴管内皮细胞的细胞骨架和体外成管能力有明显的抑制作用。,2023/10/18,47,展 望,目前，淋巴管生成及其调控机制,淋巴管生成的促肿瘤转移作用等已成为恶性肿瘤研究领域中的一项重要课题。对于肿瘤与新生淋巴管的研究,在一些方面取得长足的进展,但在肿瘤淋巴管生成与肿瘤淋巴转移中仍有许多问题尚未明确。随着研究的不断深入,抗肿瘤新生淋巴管会同抗肿瘤血管生成一样，成为抗肿瘤治疗的新靶点，抗肿瘤新生淋巴管治疗有望成为肿瘤生物治疗的新模式,具有良好的临床应用前景。,Thank You!,2023/10/18,49,
