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1、第七章微生物的遗传变异,遗传变异的物质基础微生物的基因突变基因重组微生物遗传变异知识的应用菌种的衰退复壮和保藏,内容提要,遗传和变异是生物体最本质的属性之一。在遗传性适宜的环境条件下时，子代与亲代性状相似的现象叫遗传。子代与亲代或子代之间性状不同的现状叫变异。对微生物遗传变异规律的深入研究，不仅促进了现代生物学的发展，而且还为微生物育种工作提供了丰富的理论基础。,第一节 遗传与变异的物质基础,（一）核酸遗传变异的物质基础（3个经典实验）,（二）遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式,1、经典转化实验,Griffith是第一个发现转化现象的，虽然当时还不知道称之为转化因子的本质是什么，但是他的工
2、作为后来Avery等人进一步揭示转化因子的实质，确立DNA为遗传物质奠定了重要基础。,（一）核酸遗传变异的物质基础（3个经典实验）,转化实验,材料,方法,动物实验,细菌培养实验,S型菌无细胞抽提液试验,有 荚 膜菌落光滑分泌毒素致 病,无 荚 膜菌落粗糙无 毒不 致 病,SSS三个血清型,RRR三个血清型,实验材料：肺炎双球菌,转化实验（1）动物实验,转化实验（2）细菌培养实验,转化实验（3）S型菌无细胞抽提液试验,噬菌体感染实验,步骤,1：用含同位素35,P32的培养基培养大肠杆菌,结果：上清液中含15%放射击性；沉淀中含85%放射性,2：让T2感染上述大肠杆菌使其打是S35P32标记,3：
3、,植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒.,植物病毒的重建实验,甲乙r 感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒,乙甲r 感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒,原始株 拆开 重建 感染 分离纯化,植物病毒的重建实验,七个水平细胞水平细胞核水平染色体水平核酸水平基因水平密码子水平核苷酸水平,三 遗传物质在细胞内的存在部位和方式,基 因 突 变,染色体畸变,第二节、微生物的突变,DNA损伤的修复,概念突变：指遗传物质发生数量或结构变化的现象。变异：突变导致性状的改变叫变异。基因突变：指一个基因内部遗传物质结构或DNA序列的任何变化，包括一对或少数几对的缺失、插入或置换，导
4、致遗传性状的变化。基因型：指贮藏在遗传物质中的信息，即DNA碱基序列。表型：指可观察或检测到的个体性状或特征，是特定的基因型在一定环境条件下的表现。,突变的特点,基因突变,突变的机制,突变类型,微生物突变体的主要类型,形态突变型,菌落形态突变型,菌体形态突变型,生化突变型,营养突变体(营养缺陷型),发酵突变体,抗性突变体,条件致死突变体,抗原突变型,产量突变型,按突变实质分,毒力突变型,致死突变型,（二）基因突变的特点(5个特点),1 随机性2 稀有性3 独立性4 稳定性5 可逆性,基因突变随机性和不对应性的证明,变 量 试 验,涂 布 试 验,影印培养试验,(在同一个大管中作整体培养),3
5、7 1 4 4 3 5,抗噬菌体菌落数 抗噬菌体菌落数,变量试验,涂布试验,影印培养试验,基因突变机制,移码突变,染色体畸变,碱基的置换,一对碱基被另外的一对碱基置换。转换(transition)：即DNA链中的一个嘌呤被嘌呤或嘧啶被嘧啶所置换。颠换(transversion)：即一个嘌呤被嘧啶或嘧啶被嘌呤所置换。,1 诱变的机制,(1)碱基的置换,碱基的置换,直接引起置换的诱变剂,间接引起置换的诱变剂,碱基的置换,T：烯醇式,.,5-BU:酮式,5-BU:烯醇式,碱基的置换,间接引起置换的诱变剂,碱基的置换,烯醇式,酮式,移码突变,分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起,造成突变点以后全部遗传
6、密码转录与转释发生错误,增添一个碱基,缺少一个碱基,碱基的置换,染色体畸变,某些理化因子，如射线，紫外线，亚硝 酸等，除能引起点突变外，还会引起DNA分 子大损伤，包括染色体易位，倒位，缺失，重复等，即为染色体畸变。,染色体畸变,紫外线诱变作用机理,可使链裂断，破坏核糖和磷酸间的键联,引起胞嘧啶和尿嘧啶产生水合作用造成氢键断裂,能使胸腺嘧啶成二聚体，使结构发生改变,转座因子(transposible element),跳跃基因(jumping gene)在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序。,染色体畸变,插入序列(insertion sequence)：分子量小，0.71.4
7、kb，只能引起转座效应而不含其它任何基因。,转座子(Tn,transposon)：分子量为225kb，含有几个到十几个基因。能插到受体DNA分子的许多位点上。,Mu噬菌体(mutator phage)：是E.Coli的一种温和噬菌体，分子量大，约37kb，含20多个基因，可以引起插入突变。,DNA的损伤修复 DNA的损伤：DNA在复制时产生错配、病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏DNA的双螺旋结构，从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。若DNA的损伤或错配得不到修复，会导致DNA突变。其主要形式：一个或几个碱基被置
8、换 插入一个或几个碱基 一个或多个碱基对缺失 DNA的损伤修复 5种修复途径:错配修复、光复活修复、切除修复、重组修复和诱导修复（亦称暗修复）。,光复活修复：400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上的TT（或CC，CT）二聚体。（包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无）切除修复：将DNA分子中的受损伤部分切除，以完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA连接酶均参与。（发生在DNA复制前）,重组修复（发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生的缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。诱导修复：造成DNA损伤或抑制复
9、制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应,称为应急反应(SOS response)。此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的DNA聚合酶。所以会有2种结果：修复或变异（进化）。,细菌的基因重组,原核微生物 通过转化、接合、转导、原生质体融合等形式进行 一 部分物质转移和基因重组。,转化(transformation),几个概念：转化、转化因子、感受态,转化过程,转化的特点,转 化(transformation),受体细胞直接吸收了来自供体细胞的DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。,转化因子,转化是游离的片断的转移和重组,游离的
10、片断叫转化因子,转化因子由供体提供,自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生，,实验室里通过提取获得,双链有转化能力，单链没有.,受体细胞能接受转化的生理状态称为感受态，只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，从出现到消失约为分钟(对数期的中期),感受态,感觉态出现原因,细菌失去部分细胞壁的结果,细菌在细胞表面产生某种引起,感受态的决定决定因素,细胞遗传性决定,和菌龄有关,环腺苷酸CAMP可提高1000 倍,Ca2+能促使细胞进入感受态,感受态因子,是受体细胞表面上的一种蛋白质,功能使转化因子结合在受体细胞表面,每个受体细胞表面约有30-80个转化因子结合点，当转化因子结合到受体表面结合点上时，DNA
11、一条链被受体细胞膜上的核酸酶分解，另一条链进入受体细胞，通过整合与受体细胞进行基因重组，有人发现DNA也可通过双链形式进入受体细胞形成双倍体的转化子。,转化过程,转化过程,转化的特点 不需两个细胞直接接触，供体DNA提取出来，注入受体即可。,转导的种类,遗传物质通过噬菌体的携带而转移的基因重组,转导的发现,转导(transduction),转导的特点,完全普遍性转导(compietetransduction),鼠伤寒沙门氏菌,A-B+色氨酸缺陷型,A+B-组氨酸缺陷型,低频转导（LFT）裂解物的形成,局限转导,转导的特点,需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触,噬菌体DNA不接合到寄主染色体,
12、噬菌体蛋白质包裹寄主任何一部分DNA片段,噬菌体DNA整合到寄主染色体上,噬菌体DNA与寄主染色体特定基因发生交换,普遍性转导,局限性转导,接 合 及 其 发 现,因子和接合,接合(conjugation),雄性菌株与雌性菌株接合结果,接 合 及 其 发 现,通过细胞间的直接接触能进行大段的转移的过程，叫接合,因子和接合,雄性菌株与雌性菌株接合结果,F-,三者根本区别在于DNA转移的方式不同,转化：供体DNA片断注入受体细胞，通过细胞膜,接合：供体进入受体通过性纤毛,转导：供体DNA片断通过媒介噬菌体携带进入受体,(四)原生质体融合,通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产
13、生重组子的过程，称为原生质体融合或细胞融合。,原生质体融合的一般原理和主要过程,先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶(如细菌可用溶菌酶或青霉素处理，入线菌可用溶菌酶或相应的脱壁权衡利弊，真菌可用蜗牛酶或相应的脱壁酶等)去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁 或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子,溶源转变,温和噬菌体的基因整合到宿主核基因组上的现象,温和噬菌体并不携带外源供体菌的基因,这种温和噬菌体是完整的，而不是
14、缺陷的,获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是转导子,获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失,染色体外遗传因子的转移与重组,一、质粒 转移性质粒、非转移性质粒,二、细菌转座因子插入序列：只含有编码转座所必需的基因转座子：含有编码转座所必需的基因和其他抗性基因转座噬菌体：温和噬菌体,（一）有性杂交（二）准性杂交菌丝联结异核体的形成形成双倍体分离子的产生,第四节、真核微生物的杂交育种,遗传变异知识的应用,诱变育种的定义,诱变育种,诱变育种就是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后设法采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的突变株，以供生产实践或
15、科学实验之用。诱变育种除提高产量外，还可改进产品质量、扩大品种和简化工艺等目的。它具有方法简便、工作速度快和收效显著等优点，仍是目前最广泛使用的育种手段。,效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1 单位,从 青 霉 素 产 量 看 诱 变 育 种,诱变育种的基本环节,诱变育种工作中应考虑的几个原则,选优良的出发菌株,处理单孢子（或单细胞）悬液,选用最适剂量,设计或采用高效筛选方案或方法,利用复合处理的协同效应,利用和创造形态，生理与产量间的相关指标,选择简便有效的诱变剂,挑选优良的出发菌株,生产中用过的自发变异菌株,采用具有有力性状的菌株,采用已发生其他变异的菌株,采用前体或最终产物代谢高的
16、菌株,采用增变菌株,处理单孢子（或单细胞）悬液,芽孢杆菌应处理芽孢,放线菌，霉菌应处理孢子,细菌指数期，放线菌霉菌要稍加萌发后使用,出发菌株应制成均匀悬夜,选择简便有效的诱变剂,选用最适剂量,剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示,合适剂量：能扩大变异幅度又能促使 变异移向正变范围的剂量,充分利用复合处理的协同效应,两种或多种诱变剂先后使用,同种诱变剂重复使用,两种或多种诱变剂同时使用,利用和创造形态，生理与产量间的相关指标,淀粉酶变色圈试验,变色圈大的为淀粉酶高产菌落,1、初筛：以量为主2、复筛：以质为主,2、诱变育种的步骤,设计或采用高效筛选方案或方法,第一轮,第二轮,五个出发菌株,突变株的筛选
17、方法,高产突变菌株的筛选方法,抗性突变体的筛选方法,营养缺陷型的的筛选方法,与突变株的筛选相关的几个概念,与突变株的筛选相关的几个概念,相关培养基,基本培养基,完全培养基,补充培养基,三类遗传型,野生型 A+B+,营养缺陷型型A+B-,原养型 A+B+,高产突变株的筛选,琼脂块培养法筛选 春日霉素高产菌种,营养缺陷型的筛选办法,诱变剂处理,淘汰野生型：青霉素浓缩法、菌丝过滤法、梯度培养法、差别杀菌法,检出缺陷型：夹层培养法、限量补充培养法、逐个 检出法、影印接种法,鉴定缺陷型,中间培养,淘汰野生型（青霉素浓缩法）,淘汰野生型（菌丝过滤法）,梯度培养皿法,含异烟肼,接敏感菌含突变株,淘汰野生型（
18、差别杀菌法）,1.适用于细菌的芽孢2.原理：将诱变处理的芽孢接种到基本培养基上，野生型的芽孢生长成营养细胞，而缺陷型的不能生长成营养细胞。,检出缺陷型（夹层培养法）,检出缺陷型（限量补充培养法）,微量蛋白质的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株,检出缺陷型（逐个检出法）,检出缺陷型(影印接种法),鉴定缺陷型,生长谱法：基本培养基+氨基酸 基本培养基+维生素 基本培养基+嘌呤或嘧啶,目的基因（即外源基因或供体基因）的取得载体系统的选择，目的基因与载体重组体的构建，重组载体导入受体细胞，工程菌或工程细胞株的表达、检测以及实验室和一系列生产性试验等。,第五节 基因工程,基本操作包括：,基因工程的应
19、用,在生产多肽类药物、疫苗中的应用改造传统工业发酵菌种动、植物特性的基因工程改良基因工程在环境保护中的应用,第六节、菌种的衰退、复壮和保藏,一、菌种的衰退与复壮二、菌种的保藏,菌种的衰退与复壮,菌种衰退指群体中退化个体再数量上占一定比例后，表现出菌种生产性能下降或优良性状丧失的现象。复壮是指菌种已发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，从而恢复该菌种原有典型性状的一种措施。,衰退的防止,1.控制传代次数2.创造良好的培养条件3.利用不同类型的细胞接种传代4.采用有效的菌种保藏方法,菌种复壮,1.纯种分离2.通过寄住进行复壮3.淘汰以衰退的个体,菌种保藏,原理：创造一个最有利于菌种休眠的环境，减少传代,方法：1.低温保藏法2.隔绝空气保藏法：石蜡油保藏法、橡皮塞密封保藏法、琼脂柱穿刺封口保藏法3.干燥保藏法：砂土管保藏法、真空冷冻干燥法4.寄住保藏法,
