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1、4.色谱分离,Chromatographic resolution也称色谱法（chromatography）色谱分离是分离科学的一次革命。,主要内容,4.1 概述4.2 色谱分离的分类 4.3 生物工程中的色谱分离4.4 色谱分离的基本理论4.5 吸附色谱4.6 离子交换色谱4.7 分配色谱4.8 凝胶色谱4.9 高速逆流色谱4.10 径向色谱分离法4.11 连续环状色谱分离法,4.1 概述,4.1.1 色谱法的定义4.1.2 色谱法的发展简史4.1.3 色谱法的特点,4.1.1 色谱法的定义,色谱法chromatography是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分
2、通过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。,凡是色谱分离都具有stationary phase和mobile phase。固定相是不动的，流动相对固定相作相对的运动。被分离的组分与流动相和固定相有不同的作用力。这种作用力有吸附力，溶解力，离子交换能力等。在色谱分析中常用分配系数来描述组分对流动相和固定相的作用力的差别：K=Cs/Cm 分配系数的差异是色谱分离的根本原因。,4.1.2 色谱法的发展史,色谱法的诞生常见的分离方式如过滤、蒸馏、沉淀、结晶、离心、萃取、膜分离等在分离复杂的混合物时就显得力不从心了。1903年，M.C.Tswett 进行了分离植物叶中
3、各 种色素的实验。创立了 色谱法。,It is very instructive to observe the adsorptionphenomena during filtration through a powder.First a colourless,then a yellow（carotene）liquidflows out from the bottom of the funnel,while abright green ring forms at the top of the inulincolumn,below which a yellow ring soon appears.
4、On subsequent washing of the inulin column withpure ligroin,both rings,the green and the yellow,are considerably widened and move down thecolumn.M.S.TswettTr.Varshav.Obshch.Estestvoispyt.,Otd.Biol.,14（1903）20,然而，在20多年时间里，他的新分离方法并没有受到科学界的重视。其中一个重要原因是德国著名化学家R.Willsttter对色谱法的排斥和不信任。Willsttter（1915年获诺贝尔
5、化学奖获得者）1913年在其名著“叶绿素的研究”中，称色谱法是一种“离奇的方法”，认为它不适用于制备工作，在吸附过程中，试样组分可能发生化学变化。他写道：“色谱法只能在试样很少的情况下使用，似乎不适合于制备目的”Willsttter的观点，即过分强调制备工作，也反映出当时有机化学家的一种普遍态度。因此，茨维特的技术是超越其时代的。,1930年12月，奥地利22岁研究生E.Lederer到海得堡R.Kuhn领导的化学研究所研究类胡萝卜素。他对文献进行了仔细考察，从文献中了解到茨维特的色谱技术。在Kuhn的指导下，他用碳酸钙作吸附剂，在一小色柱中，成功地分离了-、-、-胡萝卜素，并发表了三篇论文，
6、公布了他们的研究成果。这标志着色谱法的复兴。Karrer在1937年，Kuhn在1938年，Ruzicka在1939年相继获诺贝尔化学奖。从此以后，色谱法得到普遍的公认，成为最有效的分离提纯手段。,色谱法的发展1931年，Kuhn、Lederer用氧化铝和碳酸钙分离了-、-、-胡萝卜素后才引起重视。Tswett的方法是借助于各组分在固定相中吸附能力的强弱不同而进行分离的，称为吸咐色谱adsorption chromatography。1935年，Adams和Holmes 合成了离子交换树脂，并用于色谱分离，从而诞生了离子交换色谱法。,1941年A.J.P.Martin和R.L.M.Synge发
7、明了分配色谱法（partition chromatography）。1952年获诺贝尔化学奖。,Archer John Porter Martin,Richard Laurence Millington Synge,1941年Martin和Synge提出用气体代替液体作流动相的可能性。1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱法gas-liquid chromatography。1957年Golay开创了开管柱气相色谱法open-tubular column chromatography，即毛细管柱气相色谱法capillary column chromatograp
8、hy。1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论。1965年Giddings总结和发展了前人的色谱理论。,1944年R.Consden、A.H.Gorden和Martin等发展了纸色谱。1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（thin layer chromatography）得以实际应用，1956年E.Stahl对TLC的标准化、规范化及应用面做了大量工作并开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。1959年Porath和Flodin提出了凝胶色谱法（gel chromatography）。1967年Por
9、ath、Axen和Ernback成功地创立了亲和色谱法（affinity chromatography）。,20世纪60年代初，Giddings将气-液色谱理论用于液-液色谱，同时把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，于60年代末出现了高效液相色谱（HPLC）。20世纪80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，90年代未得到较广泛的应用。20世纪80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE），在90年代得到广泛的发展和应用。同时集HPLC和CE优点的毛细管电色谱在20世纪90年代后期受到重视。,4.1.3 色
10、谱法的特点,分离效率高可选操作参数多应用范围广高灵敏度的在线检测快速分离与过程自动化操作,4.2 色谱分离的分类,按分离机理不同分类 按固定相及流动相的状态分类按固定相形状分类 其他分类方法,4.2.1 按分离机理不同分类,吸附色谱Adsorption chromatography，AC是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。吸附作用力可以是物理吸附作用，也可以是化学吸附作用。物理吸附的特点是选择性低，吸附速度较快，吸附过程可逆；化学吸附的特点是有一定选择性，吸附速度较慢，不易解吸。物理吸附和化学吸附可以同时发生，在一定条件下也可以互相转
11、化。,吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的一类，传统的吸附色谱以各种无机材料为吸附剂。在此基础上发展起来的新的吸附色谱技术，如疏水作用色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）、金属螯合作用色谱（metal chelation chromatography，MCC）和共价作用色谱（covalent interaction chromatography，CIC）等，所用吸附剂一般为有机基质并通过化学修饰后制成，它们都有比较明确的作用机理，即疏水作用、螯合作用和共价作用。,离子交换色谱离子交换色谱（ion exchange chromatogra
12、phy，IEC）是基于离子交换原理进行的色谱分离。广泛用于生物大分子的分离纯化中。,亲和色谱亲和色谱（affinity chromatography，AFC）是将与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相从混合物中分离目的产物的过程。亲和作用是特殊的吸附作用。,分配色谱Distribution chromatography，DC又称为液液色谱，其原理是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。分配色谱可分为正相色谱（normal phase chromatography，NPC）和反相色谱（reversed phase chromatography，RPC）。离子对色谱ion
13、-pair chromatography。,凝胶色谱凝胶色谱（gel chromatography，GC）以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，因而又称为分子筛色谱（molecular sieve chromatography，MSC）；空间排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）。凝胶色谱分为两大类：凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）和凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）。,电色谱电色谱（electrochromatography）是
14、电泳和液相色谱的融合技术。所谓电色谱是采用电渗流来推动流动相，使得峰扩展只与溶质扩散系数有关，因而使电色谱的理论塔板数远远高于液相色谱。同时由于引入了高效液相色谱的固定相，使电色谱具备了高效液相色谱固定相所具有的选择性，使它不仅能分离带电物质。也能分离中性化合物。,4.2.2 按固定相及流动相的状态分类,气相色谱GC气相色谱（gas chromatography，GC）仅限于能够气化的物质，且主要用于分析。气相色谱包括气液色谱GLC、气固色谱GSC。液相色谱LC液相色谱（liquid phase chromatography，LPC）可分为液液色谱LLC、液固色谱LSC。超临界流体色谱超临界流
15、体色谱（supercritical fluid chromatography，SFC）是20世纪80年代中期发展起来的一种新的色谱分离技术，其流动相为超临界流体。,4.2.3 按固定相形状分类,柱色谱（column chromatography）平面色谱（planar chromatography）纸上层析（paper chromatography）薄层色谱（thin layer chromatography）,4.2.4 其他分类方法,按使用领域不同对色谱仪的分类1.分析用色谱仪又可分为实验室用色谱仪、在工业生产流程中为在线连续使用的色谱仪和便携式色谱仪。2.制备用色谱仪又可分为实验室用制备
16、型色谱仪和工业用大型制造纯物质的制备色谱仪。制备型色谱仪可以完成一般分离方法难以完成的纯物质制备任务，如纯化学试剂的制备，蛋白质的纯化。,根据操作压力不同进行分类可分为低压色谱分离（0.5 MPa）、中压色谱分离（0.55 MPa）和高压色谱分离（550 MPa）。低压色谱分离的装置比较简单，操作费用低，但流动相流动速率慢，分离时间长，常常使生物活性物质活性降低。高压色谱分离技术的特点是，流动相流动速率高，分离时间短，分辨率高。缺点是设备费昂贵，此外在高压作用下有些生物物质有变性的可能。,根据展开方式进行分类根据洗脱操作时展开方式的不同可分为为洗脱展开（elution development）
17、、迎头分析（frontal analysis）和顶替展开（displacement development）三种。洗脱展开（elution chromatography）。,迎头分析法与一般的固定床吸附操作相同，大量料液连续输入到色谱柱中，直到在出口处发生溶质穿透（breakthrough）。迎头分析中各个溶质按其在固定相和流动相间分配系数的大小次序穿透，只有最先穿透的（分配系数最小）的组分能以纯粹的状态得到部分回收，之后的流出液均为双组分或双组分以上的混合物。,顶替展开与洗脱展开相似，唯一不同之处是：顶替展开所采用的洗脱液（流动相）中含有与固定相的亲和力比料液中各个组分都大的物质，这种物质称
18、为顶替剂（displacer）。顶替剂将料液中所含溶质按其与固定相亲和力的大小不同从柱中次序顶替（洗脱）出来。顶替展开法可使溶质区带得到浓缩，适于大量处理稀溶液。,根据流动方式进行分类一般色谱操作中流动相从固定床的一端输入，沿轴向流向另一端，属于轴向流色谱（axis flow chromatography）。径向流色谱（radial flow chromatography）是在柱心设一通透性细管，料液及流动相从柱的圆周引入，从外表面沿径向流向柱心，透过中心管流出。连续环状色谱（continuous annular chromatography）。拟移动床色谱（simulated moving
19、bed chromatography）。,4.3 生物工程中的色谱分离,色谱和电泳是目前所知最好的两种分离方法，其塔板数可达百万数量级。在基因工程产品中，色谱分离占有核心地位。色谱分离的规模 色谱分离方法的选择 分析色谱与工业色谱的比较,4.3.1 色谱分离的规模,与一般分离技术相比，色谱分离的规模是相当小的。根据分离时一次进样量的多少，色谱分离的规模可分为如下4类：色谱分析：10 mg半制备（或称中等规模制备）：1050 mg制备（或称样品制备）：0.110 g工业生产：20 g,4.3.2 色谱分离方法的选择,应用色谱分离方法制备和生产生物体组成成分，包括各种初级代谢产物、次级代谢产物以及
20、各种生物大分子，使用色谱技术来分离纯化这些物质时常根据如下几个方面来选择不同的色谱分离方法。目的产物的分子结构、物理化学特性、及分子量的大小；主要杂质，特别是分子结构、大小和理化特性与目的产物相近的杂质的成分与含量；目的产物在色谱分离过程中生理活性的稳定性。,4.3.3 分析色谱与工业色谱的比较,应用色谱技术范围的不同分析色谱的流动相包括气相和液相，固定相形状包括柱、纸和薄板，而制备和工业色谱主要是采用以液相为流动相的柱色谱。操作上的不同在分析色谱中，进样量愈小愈好，因此出现了当今的微型毛细管柱色谱；在制备和工业色谱中，则要求进样量越多越好，色谱柱也应适当大些，从而出现了大直径的径向色谱柱（r
21、adial flow chromatographic column，RFCC）。,色谱分离理论上的不同1.理论塔板数的不同对于生物大分子而言，分离的好坏往往与理论塔板数没有明显的关系。2.分配系数的不同 线性色谱与非线性色谱3.样品保留值与峰高的不同制备色谱和工业色谱中，不能根据保留值定性，色谱的峰高也不能作为制备色谱和工业色谱定量分析的指标。,4.4 色谱分离的基本理论,4.4.1 塔板理论4.4.2 速率理论,4.4.1 塔板理论,塔板理论Plate Theory就是把分配色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，挥发度大的组分最先从“塔顶”（即柱出口）逸出
22、，由于流动相连续地进入柱内，为了便于研究组分在两相间的分配行为。,塔板理论的基本假设：柱由完全相同的不连续的体积单元组成，每一个体积单元犹如精馏塔中的一块塔板，而它在柱内又是不存在的，故称理论塔板。每一块塔板的一部分空间为固定相所占据，另一部分空间为流动相所占据。这后一部分空间称为塔板体积（Vm）。流动相从柱入口以一个个Vm 体积，脉冲式地加入。组分在每块塔板上的两相间瞬时达到平衡。分配系数在所有塔板上都为常数，与组分浓度无关即相当于线性等温线的情况。忽略塔板间的纵向分子扩散。,流出曲线 经N次平衡后，流动相中的组分分数q与在固定相组分分数p符合二项式分布：（p+q）N 上例中K=1，p=q=
23、1/2，展开为：（p+q）4=p4+4qp3+6q2p2+4q3p+q4=1/16+1/4+3/8+1/4+1/16 若K=2，p=0.667，q=0.333，则（p+q）4=0.198+0.395+0.296+0.099+0.012 当N50时，流出曲线对称呈正态分布。,进流动相,平衡 K=1,1/4 2/4 1/4,1/8 3/8 3/8 1/8,1/2,1/16 3/8 1/16,柱效 n=5.54（tR/W1/2）2=16（tR/W）2 neff=5.54（tR/W1/2）2=16（tR/W）2 Heff=L/Neff分配色谱与精馏的差别,4.4.2 速率理论 Rate Theory,
24、塔板理论满意地解释了色谱流出曲线呈高斯分布；论证了组分的保留值与分配系数间的关系；并能成功地用于塔板数的计算。塔板理论的局限性塔板理论作了五个不符合实际的假设。它还排除了一个极其重要的参数流动相速度，并忽略了两相体积的大小。由于排除了流动相速度这一参数，因而不能解释在不同流动相速度时的柱效不同的原因。从本质上说，塔板理论的缺点在于忽视了组分分子在两相中扩散和传质的动力学过程。,色谱过程中的扩散和传质对速率理论作出全面解释的是荷兰化学家Van Deemter等，以后又由美国化学家J.Calvin Giddings作了进一步的改进。当组分的谱带向柱出口迁移时，在非理想线性色谱状态下必然要展宽。在柱
25、内有四种受动力学控制的过程，使谱带偏离理想状态而展宽。这四种过程是涡流扩散、纵向分子扩散、流动相中传质和固定相中传质。,涡流扩散 eddy diffusion当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒的障碍，不断改变方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，导致谱带展宽，故称涡流扩散。由涡流扩散引起的展宽程度可表示为：2e=2dpL 为填充不规则因子，它决定于固定相颗粒的直径dp、粒度范围和填充情况；L为柱长。,纵向分子扩散 longitudinal diffusion 纵向分子扩散指沿x轴方向的扩散，它是由浓度梯度造成的。由纵向分子扩散引起的展宽程度可表示为：2l=2
26、DmL/u 为弯曲因子，亦称阻碍因子，它反映固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况，一般小于1；u为流动相线速；Dm为组分在流动相中的扩散系数。Dm1/M。同一组分在氢气中的扩散系数要大于在氮气中的扩散系数，因此用氢气作流动相对，纵向分子扩散更严重。,流动相中传质阻力 组分从流动相主体扩散到流动相与固定相的界面，以便发生相转移，妨碍这一扩散过程的阻力称为流动相传质阻力。由流动相传质阻力所引起的展宽程度可表示为：2m=dp2Lu/Dm 是由柱填充性质决定的因子，与固定相性质及构型有关。dp为固定相颗粒的平均直径。影响展宽的因素有：dp、u、Dm、L,固定相中传质阻力 组分到达两相界面后，就
27、要扩散到固定相内部达到分配平衡，然后又返回两相界面。妨碍这一过程的阻力称为固定相传质阻力。由固定相中传质阻力引起的谱带展宽程度可表示为：2s=qkdf2Lu/（1+k）2Ds）q 是与固定相性质、构型有关的因子，对均匀液膜，q为2/3；k为分配比。df为固定液的平均厚度。Ds为组分在固定相中扩散系数。影响2s 因素有：df、Ds、u、L、k,对于吸附色谱，其分配平衡受吸附-解吸动力学速率控制，固定相中传质阻力引起的谱带展宽程度可表示为：2sa=2kLu/（1+k）2Kd）Kd为吸附速率常数。,速率理论方程式 H=2/L=2e+2l+2m+2s=2dp+2Dm/u+dp2u/Dm+qkdf2u/
28、(1+k)2Ds)H=A+B/u+Cu 这里A涡流扩散相 B纵向扩散相 C传质阻力相,4.5 吸附色谱,吸附色谱的一般操作羟基磷灰石色谱疏水作用色谱金属螯合色谱共价作用色谱,吸附剂（固定相）对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的。无机基质吸附色谱（多种作用力）疏水作用吸附色谱（疏水作用）共价作用吸附色谱（共价键）金属螯合作用吸附色谱（螯合作用）离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱。,4.5.1 吸附色谱的一般操作,吸附剂的选择按化合物的种类可分成无机基质色谱填料和有机基质色谱填料两大类；按形状可分成球形和无定形两类；按硬度可分成硬质色谱填料、半硬质疑胶色谱填料及一些如琼脂糖的生物软胶；按结
29、构可分成表面多孔薄壳色谱填料和全多孔色谱填料两类。,装置一般由进样、流动相供给、色谱柱、检测及流分收集器等部分构成。,流动相供给部分一般包括贮液罐、高压泵、液体混合室及梯度洗脱系统。检测器根据组分的物理化学特性，例如紫外吸收、荧光性、电导率、旋光性以及可见光光密度等，进行在线检测。流分收集器是将柱后流出的液体，定时定量分别收集的仪器。有滴数式、容量式、质量式等若干种。,4.5.2 羟基磷灰石色谱,羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）是一种磷酸钙晶体，基本分子结构为Ca10(PO4)6(OH)2。HAP的吸附主要基于钙离子和磷酸根离子的静电引力，即在HAP晶体表面存在两种不同的吸附
30、晶面，分别起阴、阳离子交换作用。A W K Tiselius et al于1956年提出。,1956年Tiselius型羟基磷灰石用于蛋白质分离1986年后出现了高效化的商品球形HAP吸附剂，如Bio-Rad、Sigma、高研（Koken）、旭光学（Asashi Optical）、东压燃料工业（Toatsu）等公司均有产品出售。由于HAP晶体表面结构特别，吸附机理特殊，可用于识别DNA及RNA的单链和双链。可分离IEC和HIC难于分离的蛋白质体系。,HAP色谱通常以磷酸盐缓冲液为流动相，采用提高盐浓度的线性梯度脱法。在中性pH环境下酸性蛋白质（pI7）主要吸附于C点，碱性蛋白质（pI7）主要吸
31、附于P点。利用磷酸盐缓冲液（K2HPO4KH2PO4）为流动相洗脱展开时，磷酸根离子在C点竞争性吸附，交换出酸性蛋白质，而K在P点竞争性吸附，交换出碱性蛋白质。HAP吸附剂价格便宜，远低于离子交换剂，适用于大规模分离纯化过程，已成为单克隆抗体的主要纯化手段。,如人肿瘤坏死因子（human tumour necrosis factor，hTNF）利用HAP层 析可分离得到4个 洗脱峰。,4.5.3 疏水作用色谱,疏水作用色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）是利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附
32、剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的一种色谱法。,在离子强度较高的盐溶液中，蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏，裸露出疏水部位，疏水性相互作用增大。所以，蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相离子强度的提高而增大。常用的疏水性配基主要有：苯基短链烷基（C3C8）烷氨基醚基聚乙二醇,疏水性吸附作用与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，一般配基修饰密度在1040 mol/cm3之间。,影响疏水性吸附的因素 离子强度及种类除离子强度外，离子的种类亦影响蛋白质的疏水性吸附。在高价阴离子的存在下，疏水性吸附作用力较高。HIC分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等盐溶
33、液为流动相，在略低于盐析点的盐浓度下进料，然后逐渐降低流动相离子强度进行洗脱分离。,破坏水化作用的物质SCN，CIO4和I等半径较大、电荷密度低的阴离子具有减弱水分子之间相互作用。因此，这类阴离子称为离液离子（chaotropic ion）；相反盐析作用强的高价阴离子（如SO42，HPO42等）的作用正好相反，称为反离液离子（antichaotropic ion）。在离液离子存在下疏水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱。除离液离子外，乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降低蛋白质的疏水性吸附作用，经常用做洗脱促进剂。,表面活性剂表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的
34、疏水性吸附。根据这一原理，难溶于水的膜蛋白质可添加一定量的表面活性剂使其溶解，利用HIC法进行洗脱分离。温度疏水性吸附与一般吸附相反。蛋白质疏水部位的失水有利于疏水性吸附，而失水是吸热过程，即疏水性吸附为吸热过程。,HIC分离蛋白质,HIC的特点HIC可作为IEC的补充工具。可直接分离盐析后的蛋白质疏水性吸附剂种类多，选择余地大疏水性相互作用机理比较复杂 例如，鼠肝细胞色素C氧化酶可被Octyl Sepharose完全吸附，而用Decyl Sepharose为吸附剂时，吸附作用降低；在Butyl Sepharose上部分吸附，而在Phenyl Sepharose上则完全吸附。据推测，发生这种现
35、象的原因是该酶与苯环之间可产生-健。,4.5.4 金属螯合色谱 Metal chelate chromatography,首先要制备金属螯合介质：琼脂糖环氧活化后与亚氨二乙酸盐，HN:(CH2COO)2Me偶合，形成带有双羧甲基氨基的琼脂糖。,Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子（electron donor atom）产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基的结合作用最强。除了双羧甲基氨基外，可以作为螯合形成基团的还有：水杨酸基，8-羟基喹啉基，氨
36、基琥珀酸基等。在中性条件下，金属螯合色谱填料能与蛋白质外露的组氨酸上的咪唑基及半胱氨酸上的巯基结合，交换配基。,MCC分离时，必须使金属离子对色谱填料凝胶的亲和力大于对欲分离物质的配位亲和力。金属螯合色谱主要用于要依赖金属或直接与金属作用的蛋白质、肽类、核苷酸、核酸及酶的分离与纯化。常在pH值为68时蛋白质可被吸附，洗脱一般降低pH值、增加离子强度或在缓冲液中加入螯合剂如EDTA等方法进行。,4.5.5 共价作用色谱,共价作用色层分离法是根据巯基化合物与色谱填料上二硫键之间的共价化学反应面进行的色谱分离的方法。SH基与SS能组成一组氧化-还原体系。,首先要制备色谱填料。葡聚糖凝胶通过CNBr方
37、法活化后，先后用谷胱甘肽及2,2-吡啶基二硫化合物处理，得到谷胱甘肽型二硫键色谱填料。,凝胶也可通过环氧氯丙烷活化后，再用硫代硫酸盐处理，得到还原型的巯基丙基型凝胶，最后用2,2-吡啶基二硫化合物活化便得到巯基丙基型的二硫健色谱填料。也可用交链聚丙烯酰胺作材料制得带巯芳基的活性色谱填料。,共价作用色谱分离法的操作过程：吸附 蛋白质中的半胱氨酸基，与色谱填料上的二硫键发生共价交换反应，蛋白质被结合到色谱填料上。如果吸附后，柱上有剩余的未反应的巯基吡啶基基团，可用pH值4.0低浓度（4 mmol/L）的二硫苏糖醇，0.1mol/L醋酸钠缓冲液洗涤除去。,洗脱 洗脱可以用L-半胱氨酸，巯基乙醇，谷胱
38、甘肽，以及二硫苏糖醇等巯基化合物，在中性条件下进行。洗脱时，若使用还原力逐次增加的巯基化合物或者逐渐增加巯基化合物的浓度，都可以增加蛋白质的洗脱分辨率，提高选择性。洗脱时，释出的吡啶-2-硫酮是一个发色化合物，在343 nm处检出。,再生过程 洗脱后的色谱填料，需用2,2吡啶基二硫化合物处理再生。对于还原型的巯基丙基琼脂糖还必须在80下回流3小时。二硫键色谱填料价格较贵，再生操作麻烦，目前尚未大规模的应用。但是共价结合具有特异性，牢固并且在适当的操作条件下还可获得较高的收率和纯度，故这种方法在某些领域中，特别是在蛋白质序列分析过程及其结构研究中，有着特殊的作用，甚至还可能成为最方便快速、简单的
39、方法而受到欢迎。,4.6 离子交换色谱,离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示：m（I）AIBm其中I为流动相的离子强度，A和B为常数，m为离子强度无限大时溶质的分配系数，是静电相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配。,对于蛋白质等两性电解质，常数A和B为pH的函数。B为溶质的静电荷数与离子交换基的离子价数之比。蛋白质为多价电解质，在pH偏离等电点的溶液中净电荷数常为两位数以上，故B值比较大。一方
40、面蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感，即离子强度的微小改变，就会引起分配系数的很大变化；另一方面，不同蛋白质的B值可能相差很大。因此，如果采用离子强度不变的流动相进行恒定洗脱，两种蛋白质的洗脱体积相差很大，甚至分配系数大的蛋白质很难洗脱。,用于蛋白质等生物分子离子交换的阴离子交换基有DEAE（二乙胺乙基，适用范围：pH8.6），QAE（季铵乙基）。阳离子交换基为CM（羧甲基，适用范围pH4），P（膦酸基）和SP（磺丙基）。常用于制备离子交换剂的介质有纤维素类、葡聚糖系（Sephadex）、琼脂糖系（Sepharose、Bio-Gel A）、聚乙烯醇系（Toyopearl）和苯乙烯系（TSK g
41、el PW）等。,IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用线性梯度洗脱法（linear gradient elution）、逐次洗脱法（stepwise elution）。,IEC的应用,特点归纳而言，IEC具有如下的特点；料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下操作；应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长较短；产品回收率高；商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低于亲和吸附剂。但是，IEC的操作变量远多于GFC，影响分离特性的因素非常复杂。,4.7 分配色谱,分配色谱法是靠溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法。载体载体是惰性、没有吸附能力，能吸留较
42、大量的固定相液体。分配柱色谱法中所用的载体主要有三类：硅胶硅藻土纤维素,RPC主要用于分子量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。但由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活。溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。因此RPC多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。,反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅胶为载体，通过硅烷化
43、反应在硅胶表面键合非极性分子层制备。其中利用C18硅烷化试剂制备的反相介质最多，通称ODS（Octadecyl silica），其次是C8和C4。除硅胶外，高分子聚合物也可作为反相介质的载体，如TSK gel Octadecyl-4PW和TSK gel Octadecyl-NPR（聚丙烯酸酯-C18）等。反相介质性能稳定，分离效率高，可分离肽、氨基酸、核酸、甾类、脂类、脂肪酸、糖类、植物碱等含有非极性基团的各种物质。,4.8 凝胶过滤色谱,原理与操作GFC利用凝胶为固定相，根据中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法。,凝胶过滤介质1.对凝胶过滤介质的要求亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之
44、间不发生任何化学或物理相互作用；稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长，具有一定的孔径分布范围；机械强度高，允许较高的操作压力（流速）。,2.商品化的凝胶过滤介质种类葡聚糖系其中Sephadex G是最传统的软凝胶过滤介质之一，目前仍被广泛使用。Sephadex G是利用葡聚糖（右旋糖酐）交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙烷。Sephadex凝胶按交联度大小，分G 10G 200共八种型号。,琼脂糖系（Sepharose、Bio-Gel A）琼脂糖凝胶Sepharose是另一种较常使用的凝胶过滤介质，机械强度较低。Sepharose CL是利用环氧氯丙烷交联制备
45、的琼脂糖凝胶，机械强度较普通Sepharose高。Bio-Gel A为Bio Rad产品。聚丙烯酰胺系（Bio-Gel P）Sephacryl为丙烯基葡聚糖与N,N-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物。Superdex,SuperoseTSK gel Toyopearl HW 聚乙烯醇系Bio-beads为苯乙烯与二乙烯苯的共聚物、用于非水体系。TSK gel PW为亲水性聚乙烯。PW系列机械强度更高，适用于高压液相色谱。TSK gel SW硅胶。,凝胶特性参数排阻极限（exclusion limit）凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。例如Sephadex G50
46、的排阻极限是30 kD，即相对分子质量大于该数值的分子不能进入到凝胶网络中，其洗脱体积为V0。分级范围（fractionation range）即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。Sephadex G50的分级范围为1.530 kD。,溶胀率溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数，Sephadex G50的溶胀率为500土30。凝胶粒径凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，HETP越小，分离效率越高。凝胶粒径多用筛目或微米表示。软凝胶粒径较大，一般为50150 m（100200目），硬凝胶粒径较小，一般为550 m。例如，Sepharose和Seph
47、adex凝胶粒径分布为45165 m，而Superose和TSK Toyopearl HW系列可小到2040 m，甚至610 m。,床体积（bed volume）即1 g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。Sephadex G50的床体积为911 cm3/g干胶。空隙体积（void volume）指色谱柱中凝胶之间空隙的体积，即V0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量为2000 kD的水溶性蓝色葡聚糖（blue dextran）。对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录中一般均给出其凝胶的各种性质，如分级范围、粒径、流速与压力的关系等，可参考使用。,分配系数 K
48、d（VeVo）/Vi 0 Kd1MW与Kd的关系 Kd ablogMW,GFC的应用及特点分离纯化GFC可用于相对分子 质量从几百到，106 数量级的物质的分离 纯化。右图是一例利 用高效GFC分离骨髓 血清蛋白质的结果。,色谱柱：10300，Superose 6洗脱液：0.05molL磷酸盐0.15molL NaCl（pH7.0）流量：0.2mlmin1.IgA高聚体 2.IgA二聚体 3.IgA单体 4.IgG 5.白蛋白,脱盐GFC在生物分离领域的另一主要用途是生物大分子溶液的脱盐，以及除去其中的低相对分子质量物质。相对分子质量的测定在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数（或洗脱体积
49、）与相对分子质量的对数成正比，所以GFC可用于未知物质相对分子质量的测定。不过，GFC仅对球形分子的测量精度较高，对分子形状为棒状的物质，测量值将小于实际值。,GFC的具体优点如下：溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近100；每批分离操作结束后不需要进行介质的清洗或再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度；作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高；分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。,与其他色谱法相比，GFC的不足之处在于：仅根据溶质之间分子量的差别进行分离，选择性低，料液处理量小；经GF
50、C洗脱展开后产品被稀释。因此需要在具有浓缩作用的单元操作（如超滤、离子交换和亲和色谱等）后使用。,4.9 高速逆流色谱,高速逆流色谱（High speed counter current chromatography，HSCCC）是一种无固相载体的连续液液分配色谱技术，在重力与离心力场的作用下，其固定相被保留于分离柱内，从而避免了固相载体与样品发生化学反应变性或不可逆吸附。该技术的样品回收率高，分辨率高，既适用于微量分析也可用于大规模制备。,TBE 300V型高速逆流色谱示意图,4.10 径向色谱分离法,径向色谱柱的结构及原理如图所示。,当保持制备色谱柱直径不变，只增加柱长时，可以线性增大样品
