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1、高效慢病毒生产解决方案一、病毒类生物制品下游工艺开发的原则A先要明确项目属性，所开发的工艺的批量是多少，做这样一个工艺开发要达到怎样的一个结果，是为了减少免疫后副作用还是为了提高滴度。这些项目属性必须先明确。A其次要建立对纯化过程及纯化结果评价的方法，比如纯化，收率，活性的测定方法，以此对过程进行监控和改善。A还要对病毒的理化性质及结构有足够的了解，以变选择合适的纯化方法。A纯化方法很多，要对各种纯化方法的适用性，优缺点做足够的认知，以便我们能设计最优的方案。A最后在设计工艺之前，要对病毒的稳定性做系统的验证及分析,所有工艺设计的前提都要在保证病毒稳定的情况下去展开。二、病毒类生物制品下游工艺
2、开发的策略A在纯度和收率之前找平衡，合理取舍。纯度越高需要的纯化工艺越复杂，其对应的收率就会降低。A在众多方法中选择合适的方法并合理衔接各种方法，做好工艺衔接及方法组合。A设计好工艺之后对预期结果做简单的评估，评估其可行性，目标结果偏差，可能遇见的问题等。A最后设计好工艺之后明确工艺可优化的点，并设计优化策略。A最后就是实验设计及实验实施。病毒类生物制品制备工艺病毒及病毒载体的制备工艺微载体培养Seplife LX-MC-de1破碎 离心细胞病毒I收获培养|培养I病毒VeroMDCKSF9CHO293T溶细胞型出芽型胞内微滤死端过滤TFF超滤 孔径 通量微滤死端过泌 TFF纯 化无菌 过滤凝胶
3、过滤：Sephfe 4FF/6FF多模式： Seplife Sunre 700离子交换 Q Large Scale/HP (高刚性) 疏水层析：Butyl Seplife FF离子交换：SeMfeLX-Q400 (大孔)慢病毒载体(LV)是用于将遗传物质递送到宿主细胞中的高效载体，以用于研发和临床应用，其中包括纠正免疫缺陷和血液疾病以及用于CART细胞疗法。对于后者，LV用于改造癌症患者自身的T细胞，以提高其检测和破坏癌细胞的能力。在过去五年中，6种FDA批准的产品以373,000美元至475,000美元的价格进入市场(KymriahYescartaAbecmaBreyanziTecartus
4、和Carvykti)o生产用于修饰患者T细胞的LV的巨大成本是复杂供应链的一部分,这解释了该类产品价格高昂的原因。通过改进LV生产工艺，我们可以提高这些疗法的成本效益。在这里，我们比较了当前和正在开发的LV生产工艺的基本原理,并强调可以提高生产成本效益的改进领域。首先，可以重新审视目前基于转染的生产方法，因为它在降低成本方面似乎已经达到了极限，而稳定生产细胞系等新的替代策略有望显著降低运营成本。其次，必须仔细选择细胞平台，因为它对整个上游工艺有重大影响。例如，选择贴壁还是悬浮细胞将对规模放大和生产的成本产生相当大的影响。第三，考虑到LV的不稳定特性，适合生产的灌流工艺可以提供优于更常用的批次模
5、式的优势。在灌流过程中，不断向培养体系添加新鲜培养基，提供营养，并去除废物。该工艺支持更高的细胞活性，并减少LV在罐内的停留时间，从而提高产生的感染性颗粒的数量。这3种策略在图1和表1中进行了总结，并将在下文中进行更详细的介绍。Productionmethod:- 4-plasmidtransfection- 1-plasmidtransfection(packagingcells)- Notransfection(stableproducercelllines)Bioprocessing:Cellularplatform:Bth-Adherent-Fed-batch-Suspension,-
6、Perfusion图1：影响LV生产成本的因素的维恩图。具有成本效益的产品将来自平台、生产方法和生物工艺的组合以及持续改进。表1：生产平台和相关成本总结。Expressioncctor)AccessibleRapdturnoverMediAmaycontainserum.Poor(CproduCtbilityPoorU4bbiify.ProhtbhivecstfaECstuds.Iedoptim4tonPfeeliniCMstudiesRAOandsmall-batchGMPproduction,e.,r“。diseasesHighestcostduetoPUVnMSandtramfectio
7、nreAnsfectkmBatchfed*batchPerfusion*AccessibleIUpidturnoverSerumYeomedScUbePomfeproAibilityHhcostforciinkalstudiesleadoptimizationPrecimkalstudiesRftDMXfGMPsmeM.btchproduction,e4.fraredesesHighcostduetoPUlmidMdtramfectnreagentSuspension11Serum-feemedScaUbIeBatchtobatchreproducibilityGeneritionofcell
8、Knti$cottndtime-consuming.Requirestransfectioo.IedopimixatinPreclinicalstudiesR40andmedium-tMtchGMPproductionforgenethecpyMidngeCMSuspensionProducercellline*InductkmBetchZXdgtchPerfUSiOnSefUrTVSemediaS4UbeBatchtobatchreproducibilityTramfectionnotrequiredGenerationofcelllinei$cost-andtMTKbContuming.l
9、8batchR&DandGMPproduction,。*CommOndiseaelowestcost生产方法：四质粒转染VS.稳定生产细胞系目前，临床环境中使用的LV是通过用四质粒转染细胞生产的。三个质粒编码Gag/PohVSV-G和Rev,这些基因对LV的结构和功能至关重要。将编码目的基因序列的第四个质粒添加到转染混合物中。为LV生产选择转染策略的主要优点是快速和通用性。当开发包括多个目的基因的产品组合或优化基因序列时，此工艺是合适的，因为转染提供了从一种转基因快速切换到另一种转基因的灵活性。尽管如此,转染也有一些限制。高昂的生产成本源于生产临床材料所需的转染试剂和GMP级质粒的价格。GMP
10、级质粒的采购需求量很大，导致交货时间延迟数月，已成为生物生产的瓶颈。最后，由于转染是一个随机事件，就滴度和LV质量而言，从一种产品到另一种产品的可重复性具有很高的可变性。为了解决这些问题，研究人员在开发稳定的LV包装细胞系（如PacLV-3D4）,其可用于通过仅转染一个质粒（对应于目的基因）来产生LV或产生稳定的诱导型生产细胞系。为了设计LV包装细胞系，LV辅助基因在紧密诱导系统的控制下稳定地整合到宿主基因组中。这种诱导系统受两个分子开关的调节，其在添加两个小分子后直接和间接控制LV细胞毒性元件的表达。事实上，严格的调节是必不可少的，因为VSV-G蛋白和由Gag/Pol编码的蛋白酶对哺乳动物宿
11、主细胞具有细胞毒性。包装细胞系的开发有助于显著降低成本，因为用于LV生产时，只需要一个GMP级质粒而不是四个。然而，对于包装细胞系，目的基因仍然必须通过转染引入。为了完全不需要质粒或转染试剂，可以通过稳定转染编码目的基因的质粒,从包装细胞中产生稳定的生产细胞系。稳定生产细胞系的主要缺点是生成它们需要六个月或更长的时间Q这需要制备一个稳定的细胞池，然后进行克隆筛选以及单个克隆的完整表征，包括稳定性、诱导优化、滴度测量和整体稳健性。生成用于生产临床材料的GMP细胞库需要额外的六个月时间。总之，四质粒转染是最昂贵的系统。稳定生产细胞系是最具成本效益的替代方案，因为不需要昂贵的GMP级质粒和转染试剂。
12、然而，如果时间至关重要，包装细胞系以较低的成本而提供四质粒转染的灵活性，因为只转染一个质粒，与稳定的生产细胞系相比，时间线也更短。细胞平台：悬浮vs.贴壁细胞目前，LV通常使用贴壁HEK293细胞系生产，该细胞系在有或没有血清的培养基中生长并用四种质粒转染，虽然这个过程需要大量的操作，且可放大性较差。对于参与人数较少的小规模临床研究，这种在T型烧瓶、细胞堆栈和其它培养瓶中生产LV的方法可能是令人满意的。对于需要更大的数量时，固定床生物反应器的改进填补了使用贴壁细胞生产LV的空白，但可放大性和成本仍然受到限制。例如，根据我们的估计，就滴度而言，使用固定床生物反应器生产70L的产品与使用悬浮细胞生
13、产的200L产品相当。目前可用的最大固定床生物反应器生长面积为500m2（固定床体积为60至70L）,限制了贴壁细胞的放大。另一方面，使用悬浮细胞，如果需要，该工艺可以扩大到2,000L规模。此外，用于200L生产的一次性袋子的成本比固定床生物反应器所需的一次性单元低8倍。此外，已经报道了与固定床生物反应器内的细胞分布异质性相关的问题，这在生物工艺的角度来看，带来了额外的挑战。生物工艺：批次vs.灌流模式在生物反应器中以批次模式生产的LV在培养结束时收获，无需更换或添加新鲜培养基。作为替代方案，补料分批工艺有可能提高滴度，而无需设置复杂的灌流系统。与批次工艺类似，在生产期结束时一次性收获。然而
14、，关键是找到正确的补液方案。就上游工艺而言，第三种选择是灌流。在灌流过程中，在开始生产之前和之后连续供应新鲜培养基，并根据灌流速率，以规定的时间间隔，收集含有LV的培养基。灌流的开发部分是为了在生物药生产过程中支持细胞活性，而在大多数情况下，这也提高了病毒滴度。这是由于持续供应新鲜营养并消除废物、限制营养消耗以及对生物反应器环境进行“解毒”。对于不稳定的LV颗粒，这也意味着它们已从有害环境中移除，从而可以更好地回收感染性颗粒。原则上，灌流工艺需要更小的占地面积，因为与批次模式相比，可以使用更小的生物反应器。例如，对于一个为期4天的工艺，可以在灌流模式下收集4次收获液(假设每天一个罐体积的灌流率
15、)，而在批次模式下，在生产期结束时只收集1次收获液。然而，与批次模式相比，灌流工作的主要缺点是设置和操作的复杂性更高，因为需要多个泵、天平和连接，以及细胞截留装置及其控制器。其它考虑因素包括用于培养基和灌流收获液的冷藏空间。然而，更高质量的产品和更高的整体产量等好处超过了缺点。例如，我们发现，与使用我们内部制备的细胞系在3L生物反应器中培养表达GFP的模式LV的批次工艺相比，灌流的总累积滴度增加了10倍。灌流的一个关键组成部分是使用细胞截留系统，该系统将细胞截留在生物反应器中，并让LV进入收获液以进行收集。已报告用于此类应用的系统包括ViralHarvestUnit(ArtemisBiosys
16、tems)、CelliconPerfusionSolution(Millipore)TFDF技术(Repligen)和BioSep(Applikon,Getinge)。其中，BioSep是重复使用的系统,而其它技术是基于膜的一次性使用产品。载体生产工艺;使用HEK-239以及先进灌流工艺生产慢病毒载佳。)最后，下游工艺(DSP)直接受到生产方式的影响。通常，收获液用过滤器澄清以去除细胞或细胞碎片，然后进行层析捕获、浓缩以及选择性进行除菌过滤。与批次模式相比，使用基于膜的技术进行灌流可减少收获过程中的浊度和细胞副产物。因此，如果需要，在灌流模式下，澄清步骤应该不那么复杂。然而，主要问题是每天的收
17、获液是否应该被视为不同的批次，或者是否可以将所有收获液合并在一起,并在下一个纯化步骤（通常是层析）中作为一个批次进行处理。另一种选择是在生物反应器的出口处进行连续捕获步骤，但这种方法尚未成功用于慢病毒载体。拥有快速、可负担的过程中分析方法和工具将有助于快速做出这些决策。在生产过程中测量病毒滴度的能力是加速工艺开发的关键。一些方法，如IEX-HPLC和流动病毒测定法，可以提供病毒滴度估计，但仍需要更快速和精确的分析工具。总结鉴于使用贴壁细胞的成本和局限性，在候选药物开发的早期选择用于LV生产的悬浮细胞系将有助于优化规模放大和整体生物生产过程，并降低成本，如表1所示。使用转染生成LV候选产品在小规
18、模上进行候选产物筛选和先导优化的速度很快，并将及时表明产品的有效性。一旦选择了主要候选产物并启动了1期临床试验，如果有足够多的患者正在寻求治疗，则可以预见需要稳定生产系统。转染产生的LV与稳定生产系统产生的LV之间的桥接研究可以在进入2/3期研究之前进行。通用LV包装细胞系的可用性为开发生产细胞系提供了先机，并且应该取代四质粒转染工艺，因为它有可能显著降低成本和生产时间。在上游生物工艺方面，现在有几种选择可以在灌流模式下有效地将细胞与LV产品分离。目前，能够以灌流模式生产生物安全2级病毒载体的CDMO非常稀缺。虽然灌流是一种相当复杂的工艺，但对LV日益增长的需求以及灌流提高本质上不稳定的感染性LV回收的潜力，应该会推动其发展并找到更多的采用者。CART细胞疗法已显示出治疗侵袭性和难治性癌症的巨大希望，并且随着其应用的扩大，对高质量LV的需求不断增长QCAR-T是基于多个生产步骤和复杂的物流所开发的高度个性化的疗法，这解释了其高成本的原因。降低慢病毒载体生物生产的成本将有助于降低总体价格，并使更多患者能够使用这些疗法。
