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1、第四章环境污染的生物监测,第一节环境污染的生物学效应监测生物测试及方式一般毒性试验生物的分子和细胞水平检测生物致突变、致畸和致癌效应检测微宇宙法第二节环境质量的生物监测与评价概述生物监测与评价生态环境质量评级化学品生态风险评价有害物理因素的生物学效应评价,第一节 污染物的生物效应检测,生物测试及方式一般毒性试验生物的分子和细胞水平检测生物致突变、致畸和致癌效应检测微宇宙法,1.生物测试（Bioassay）：指系统地利用生物的反应测定一种或多种污染物或环境因素单独或联合存在时所导致的影响或危害。注释1：所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统各级水平上的反应。例：通
2、过水污染的生物测试可知，污染物对受测生物的毒性；各种水生生物对污染物的相对敏感性；废水所应处理的程度；允许的污染物排放指标等。,2.生物测试的方式,田间全开放式熏气系统，即把极低浓度的污染气体用密布于田间的管道通到植物周围。,2.1短期生物测试（Short Term Bioassays）主要用于测定LC50、IC50、EC50，用来快速估计污染物的毒性，评定几种不同毒物或废物对某种生物的相对毒性或评定不同生物对不同条件如温度、pH的相对敏感性等。多数采用静止式。LC50 lethal concentration 半致死浓度IC50 Inhibitory concentration 半抑制浓度E
3、C50 effect concentration半效应浓度根据测试生物，其测试时间也不同（一般不超过8d）。藻类72h；水藻类48h；鱼类96h,2.2中期生物测试（Intermediate Term Bioassays）时间为8d到90d，多数情况下为流动式。2.3长期生物测试（Long Term Bioassays）包括全部生活史的生物测试（Complete Lifecycle Bioassays）和部分生活史的生物测试（Partial Lifecycle Bioassays）目的是要测定出在持续情况下不造成有害效应的毒物最大浓度或最大允许毒物浓度（MATC）只能采用流动式，要保证试验的环
4、境条件和自然界的季节变化相符合。,2.4 受试生物的选择A对试验毒物或因子要有敏感性B具有广泛的地理分布和足够的数量，并在全年的某一实际区域范围内可获得。C受试生物是生态系统的重要组成部分，具有重要的生态学价值。D在实验室易于培养和繁殖F具有丰富的生物学背景资料，人们较清楚的了解受试生物的生活史、生长、发育、生殖代谢等。G对毒物或因子的反应能够被测定，并具有一套标准的测定方法或技术。H具有重要的经济价值和旅游价值，应考虑与人类食物链的重要关系,2.5影响生物测试结果的因素受试生物：年龄、生活阶段、尺寸大小、季节、脱皮阶段、食物等试验条件：温度、水质的温度和盐分、水流速度、溶解氧、pH等。实验室
5、差异：人员操作水平、仪器设备、统计分析方法等。,3.生物测试的标准化由于生物测试结果受众多因素影响，固，必须把测试方法标准化。在标准化的生物测试中，对一些重要的影响因子做了规定，例如：光周期、生物大小、生物量、溶解氧、pH值等。例子：水质 物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法（GBT 1326791）试验鱼种应是斑马担尼鱼(真骨鱼总目，鲤科）。试验鱼体长305mm，体重0.30.1g。新配制的标准稀释水pH为7.80.2，硬度为250mgL左右(以CaCO3计)，用蒸馏水或去离子水由下面4种溶液制备,生物测试标准化的优点：实验准确度高、结果可重复、方便实验的进行和数据的比较、可为环境管理何环
6、境立法等提供靠的数据或者结果。生物测试标准化的缺点：一般只能解答普遍关注的问题。对于而非常见的污染物、易分解污染物和混合污染物，标准化方法很难进行。,第一节 污染物的生物效应检测,生物测试及方式一般毒性试验生物的分子和细胞水平检测生物致突变、致畸和致癌效应检测微宇宙法,1.基本概念1.1毒物（Toxicant）在一定条件下，以较小剂量给予机体时，能与生物相互作用，引起生物体功能或者器质性损伤的化学物质；或者剂量虽微，但累计到一定的量，就能烦扰或者破坏机体的正常生理功能，引起暂时或者持久性的病理变化，甚至威胁生命的化合物。注释：毒物与非毒物之间不存在绝对的界限，通常一种物质只有达到中毒剂量时才是
7、毒物。例：下页表 人体内几种元素含量标准,1.2中毒（Intoxication）生物体受到毒物作用引起的功能或者器质性改变后出现的疾病状态。中毒是各种毒性作用的综合表现，包括急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒。,水俣病,骨痛病,1.3毒性（Toxicity）有毒物质接触或进入机体后，引起生物体易感部位产生有害作用的能力。毒性作用或毒效应（Toxic Effect）：化学物引起生物体损害的总称。如，苯可抑制造血功能导致贫血。无损害作用（Non-adverse Effect）：不引起机体形态、生长发育和寿命的改变，不引起机体功能容量的降低和对额外应激状态代偿能力的损害，所引起的生物化学变化一般是可逆的
8、。如，利福平口服吸收良好，服药后1.54小时血药浓度达峰值。成人一次口服600mg后血药峰浓度为79mg/L，血药峰浓度为11mg/L。该药的血消除半衰期为35小时，多次给药后有所缩短，为23小时。,损害作用（Adverse Effect）：生物体接触外化学物期间或者停止接触后，机体维持体内稳态能力下降时不可逆的。如，鼻咽癌患者放疗后，5%10%的患者出现张口困难，影响进食和讲话。8%的病人有明显的听力受损，3%的病人表现为双侧耳聋，放疗数年后，部分病人可出现颈部肌肉、皮肤纤维化，血管脆弱，中枢神经系统损伤等。危害性：有毒物质和机体接触和使用过程中，有引起中毒的可能性。如，挥发性小且易溶于水或
9、者血液的，危害性就大。危险性：某种化学物质在正常使用的条件下，引起机体发生中毒的可能性。如，“氯丹”是最危险性、持久性的污染物之一。,效应（Effect）：接触一定剂量的化学物质引起机体个体发生生物学变化。效应是对个体而言的，这种改变可用一定的计量单位表示。如，有机磷农药引起乙酰胆碱酯酶活力的降低（活力单位）。剂量-效应关系（Dose-effect Relationship）：不同剂量在个体或者群体中表现出来的量大小之间的关系。反应（Response）：接触一定剂量的化学物质后，表现一定程度的某种效应的个体在一个群体中所占的比例。反应是对群体而言的，用百分率或比值来表示，如发病率、死亡率等。剂
10、量-反应关系（Dose-response Relationship):不同剂量与质效应发生率之间的关系，是评价化学物质毒性与确定安全接触水平的基本依据。,1.4毒性试验常用参数,致死剂量或致死浓度（Lethal Dose，Lethal Concentration）：一次染毒后引起受试动物死亡的剂量或者浓度。绝对致死剂量或致死浓度（LD100、LC100）：引起一群动物全部死亡的最低剂量或者浓度。半数致死剂量或浓度（LD50、LC50）：引起一群动物50%死亡的最低剂量或者浓度。最小致死剂量或浓度（MLD、MLC）：引起一群动物中仅有个别死亡的最低剂量或者浓度。最大耐受剂量或浓度（LD0、LC0
11、）：使一群动物中虽然发生严重中毒，但全部存活无一死亡的最高剂量或者浓度。,最大无作用剂量（Maximum Noeffect Level）：是指在一定时间内，一种外源化学物按一定方式或途径与机体接触，根据目前认识水平，用最灵敏的实验方法和观察指标，未能观察到任何对机体的损害作用的最高剂量，也称为未观察到损害作用的剂量。最小有作用剂量（Minimal effect Level）：即在一定时间内，一种外来化合物按一定方式或途径与机体接触，能使某项观察指标开始出现异常变化或使机体开始出现损害作用所需的最低剂量，也可称为中毒阈剂量，或中毒阈值。,理论上讲，最大无作用剂量与最小有作用剂量应该相差极微，但实
12、际中由于受到对损害作用观察指标和检测方法灵敏度的限制，两者之间存在有一定的剂量差距。最大无作用剂量是根据亚慢性试验的结果确定的，是评定毒物对机体损害作用的主要依据。当外来化合物与机体接触的时间、方式或途径和观察指标发生改变时，最大无作用剂量和最小有作用剂量也将随之改变。所以表示一种外来化合物的最大无作用剂量和最小有作用剂量时，必须说明试验动物的物种品系、接触方式或途径、接触持续时间和观察指标。例如某种有机磷化合物在大鼠（wistar品系）经给口服予3个月，全血胆碱酯酶活力降低50%的最大无作用剂量为10mg/kg体重。,每日容许摄入量（Acceptable Daily Intake）：是以体重
13、表达的每日容许摄入量，以此量终生摄入无可测量的健康危险性（mgkg,以60kg计）。最高容许浓度（Maximum Allowable Concentration）：环境中有害物质以此浓度经生态系统直接或间接作用于人，不会引起任何损害的浓度。对车间空气、地面水、饮用水、食品及土壤中有害物质一般只制订最高容许浓度。对大气中有害物质则制订了两种最高容许浓度，即一次最高容许浓度（指任何一次测定结果的最大容许值）和日平均最高容许浓度（指任何一日的平均浓度的最大容许值），前者为防止急性有害作用的瞬间接触容许浓度，后者则为防止慢性毒作用的容许浓度。,毒作用带（Toxic Effect Zone）：表示化学毒
14、物毒性和毒作用特点的重要参数。急性毒作用带（Acutetoxic Effect Zone）：半数致死剂量与急性阈剂量（急性毒性最小有作用剂量）的比值（大于1）。急性毒作用带值小，引起死亡的危险性大。慢性毒作用带（Chronic toxic Effect Zone）：急性阈剂量与慢性阈剂量（慢性毒性最小有作用剂量）的比值（大于1）。慢性毒作用带值大，发生慢性中毒的危险性大。,半数效应浓度（EC50）：引起受试对象50%个体产生一种特定效应的药物剂量。通常指非死亡效应。半数抑制浓度（IC50）：能引起受试生物某种效应被抑制50%所需的浓度。如果将Inhibition看成是Effect，两者其实是一
15、回事。如果此效应是治疗效应，应该是EC50值越小越好。如果此效应是抑制生长的效应，那就是IC50了，那是越小越好。,2.毒物单位与分级毒物单位 空气浓度：mg/m3，mg/L 哺乳动物：mg/kg，ml/kg 水环境：mg/L，g/L毒物分级：P102-P103 6个表,3.急性毒性试验（Acute Toxicity Test）,急性毒性试验（Acute Toxicity Test）研究化学物质大剂量一次染毒或24小时内多次染毒动物所引起的毒性的试验。其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。急性毒性试验类型哺乳动物急性毒性试验水生生物急性毒性试验（鱼类
16、、水蚤类、藻类）蚯蚓急性毒性试验,动物急性毒性试验方法如下：按试验要求选择受试生物常用成年大鼠或小鼠，雌雄动物同时试验，对试验动物预先观察几天后标记编号并随机分组。预备试验和确定剂量组选用少量动物进行预备试验，找出引起动物90（或全部）死亡的剂量（即最高剂量组剂量）和引起动物10死亡（或不死亡）的剂量（即最低剂量组剂量）。在最高剂量组剂量和最低剂量组剂量的范围内，按等比级数插入若干个中间剂量（一般46组），从而确定正式试验的剂量组。,染毒方式和受试物的配制一般用灌胃法和人工熏气法。受试物的配制：配制试验所需的最高剂量浓度溶液，然后依次稀释到所需浓度。观察指标中毒症状：一般观察2448小时，最好
17、观察到绝大多数动物出现典型中毒症状。动物死亡数目和死亡时间病理检查：对于试验时立即死亡的动物，可解剖，分析死亡原因，看是技术事故还是中毒引起的死亡。,确定半数致死量（LD50）试验结果LD50值越小，毒性越大。急性毒性试验结果只能粗略地表示某化学物质的毒性，而不能全面反映其毒性。为了得到更接近实际情况的毒作用资料，通常还需要进行亚慢性、慢性毒物和蓄积毒性试验。由于动物种属、性别、染毒方式的不同，所表现的毒性也不一致，故表示LD50应注释明动物种类和染毒方式。,4.亚慢性毒性试验,亚慢性毒性是指实验动物连续多日接触较大剂量（急性LD50）的外来化合物所出现的中毒效应。亚慢性毒性试验最敏感的指标是
18、最大无作用剂量（以mg/kg体重计）：小于或等于人的可能摄入量的100倍者，表示毒性较强，应予以放弃；大于100倍而小于300倍者，可进行慢性毒性试验；大于300倍者，则不必进行慢性试验，可进行评价。,亚慢性试验期限环境毒理学与食品毒理学中所要求的连续接触为36个月，而在工业毒理学中认为13月即可。现有学者主张进行实验动物90天喂饲试验为亚慢性毒性试验，即将受试物混合物饲料或饮水中，动物自然摄取连续90天。这是由于有研究报道认为动物连续接触外来化合物3个月，其毒性效应往往与再延长接触时间所表现的毒性效应基本相同，故不必再延长接触期限。相应地主张呼吸道接触可进行30天或90天试验，每天6小时，每
19、周5天。经皮肤试验进行30天。,实验动物的选择亚慢性毒性作用研究一般要求选拔两种实验动物，一种为啮（ni）齿类，另一种为非啮齿类，如大鼠和狗，以便全面了解受试物的毒性特征。受试动物的体重(年龄)应较小，如小鼠应为15g左右，大鼠100g左右。染毒途径亚慢性毒性试验接触外来化合物途径的选择，应考虑两点：一是尽量模拟人类在环境中接触该化合物的途径或方式，二是应与预期进行慢性毒性试验的接触途径相一致。具体接触途径主要有经口、经呼吸道和经皮肤三种。,剂量选择与剂量分组剂量一般设在LD50的1/801/50。亚慢性试验的上限剂量，需控制在实验动物接触受试化合物的整个过程中，不发生死亡或仅有个别动物死亡，
20、但有明显的中毒效应，或靶器官出现典型的损伤。可参考此化合物LD50的1/201/5为最高剂量。亚慢性试验至少应设计三个染毒剂量组及一个正常动物对照组。组内动物个体体重相差应不超过平均体重的10%，组间平均体重相差不超过5%。小动物每组不应少于20只，大动物不少于68只。,观察指标一般综合性观察指标:体重变化、食物利用率、中毒症状及出现各症状的先后次序、时间均、脏器系数或称脏/体比值等。一般化验指标主要指血象和肝、肾功能等检测。病理学检查：凡是在染毒过程中死亡的动物均应及时解剖，肉眼检查后再进行病理组织学检查。必要时作组织化学或电镜镜检。试验评价可对受试物的主要作用、靶器官、最大无作用水平和中毒
21、阈值做出初步估计，为进一步开展慢性毒性试验提供依据。,5.慢性毒性试验 慢性毒性是指以低剂量外来化合物长期给予实验动物接触，观察其对实验动物所产生的毒性效应。试验目的 慢性毒性试验是确定外来化合物的毒性下限，即长期接触该化合物可以引起机体危害的阈剂量和无作用剂量。为进行该化合物的危险性评价与制定人接触该化合物的安全限量标准提供毒理学依据，如最高容许浓度和每日容许摄入量等。,试验期限 工业毒理学慢性试验动物染毒6个月或更长时间；环境毒理学与食品毒理学则要求实验动物染毒1年以上或2年。也有学者主张动物终生接触外来化合物才能全面反映外来化合物的慢性毒性效应，以及求出阈剂量或无作用剂量。接触途径 慢性
22、毒性试验多为经口与经呼吸道接触。经呼吸道接触，每日接触时间，依试验要求而定。工业毒物的试验通常每日吸入46小时。环境污染物一般要求每日吸入8小时或更长。,剂量的选择与分组 受试动物要求年龄低于亚慢性试验。设置34剂量组和1对照组，其他要求同亚慢性试验。染毒组剂量的选择可参考以下两种数据：A.以亚慢性阈剂量或其1/5 1/2剂量为慢性毒性试验的最高剂量，以这一阈剂量的1/501/10为慢性毒性试验的预计阈剂量组，并以其1/100为预计的慢性无作用剂量组。B.以LD50的1/10剂量为慢性试验的最高剂量。以LD50的1/100为预计慢性阈剂量，以LD50 的1/1000为预计的无作用剂量组。组间剂
23、量差一般以510倍为宜，最低不小于两倍。,观察指标 观察指标同亚慢性毒性试验。应重视病理组织学的检查，凡试验期间死亡的动物，都应做病理组织学检查。试验评价 对受试物在低剂量长时间接触机体时所引起的毒性作用有更深入的了解。根据敏感观察指标找出最小阈剂量和最大无作用剂量。,6.蓄积毒性试验蓄积毒性作用（Cumulative Toxicity Action）：低于中毒域剂量的外来化合物，反复多次与机体持续接触，经过一定时间后使机体出现明显的中毒表现。产生原因：V进入V消除物质蓄积：吸收量排出量，量逐渐积累增多。功能蓄积：污染物反复作用机体，引起机体一定结构和功能的变化，并逐渐累积加重，最后导致损害出
24、现。,A.蓄积系数法（Cumulative Coefficient Method）：分次给受试物后引起50%受试动物出现某种毒效应的总剂量，与一次给受试物后引起50%受试动物出现该种毒效应的比值。蓄积系数KK值愈小，蓄积作用愈强。分级：1高度；1明显；3中等；5轻度蓄积。,试验方法,固定计量每天染毒法受试动物以1/101/20LD50的固定剂量，每天染毒一次，观察动物死亡的情况。当然度剂量累计达到5个LD50以上时，表明K大于5，该污染物蓄积作用不明显。如果在染毒过程中动物相继陆续死亡，记下受试动物出现50%死亡时累计的的染毒总剂量，计算K值。,剂量递增蓄积系数法以4天为一期，第一期每只动物每
25、天给药剂量为0.1LD50，以后各期顺次递增50%（第二期为每只每天0.15LD50，第三期为每只每天0.225LD50,依次类推），直至该动物死亡一半，或继续给药至累计剂量5.0LD50以上（20d）为止。计算蓄积系数K。,B.20天蓄积试验法成年大鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半。各组剂量分别为LD50的1/20、1/10、1/5、1/2，另设溶剂对照组。每天灌胃一次，连续20天。然后观察7天。结果评价：如1/2 LD50组已出现死亡，且各剂量组动物死亡呈剂量-反应关系，则受试动物有强蓄积毒性。如1/20 LD50组有死亡，但各剂量组死亡呈剂量-反应关系，表明有中等蓄积毒性。如1/20
26、 LD50组无死亡，各剂量组死亡也剂量-反应关系，可认为无明显蓄积毒性。,C.受试生物半减期测定法生物半减期（T1/2）指一种外来化合物在体内消除到原有浓度或剂量的一半，所需要的时间。T1/2越长，蓄积作用可能性越大。T1/2直接测定很难，通常间接测定其在血液、尿液或器官组织中原有浓度降低一半所需要的时间。生物半减期T1/2y1和y2分别为给受试物后t1和t2时间测得该物质的浓度或者量。,第一节 污染物的生物效应检测,生物测试及方式一般毒性试验生物的分子和细胞水平检测生物致突变、致畸和致癌效应检测微宇宙法,1.加合物的测定A.DNA加合物的测定 DNA分子与化学诱变剂间反应形成的一种共价结合的
27、产物。这种结合激活了DNA的修复过程。如果这种修复不是发生在DNA复制前，会导致核苷酸的替代、缺失和染色体的重排。,DNA构成分子的活性位点,a.放射免疫法（RIA）用放射性同位素标记抗原，制备特异性抗体。原理：*Ag+Ag+Ab*AgAb十AgAb+*Ag(剩余)+Ag(剩余)抗体数量已知，*AgAb和*Ag(剩余)可被检测到，则可计算出样品中的Ag数量。,b.酶联免疫法（ELISA）,（1）将特异性抗体（制备某种DNA-加合物的特异抗体）（2）加受检标本（3）加检测抗体（4）加酶标抗体（5）加底物，显色,c.荧光法某些化合物的DNA-加合物具有荧光特性，故而可被检测到。荧光法不破坏DNA链
28、，并可区分加合物的不同立体异构体及DNA链上的不同位点上的加合物。,d.32P-后标记法(1)采用DNA 水解酶将DNA 降解为3-磷酸单核苷酸;(2)采用T4 多核苷酸激酶和-32PATP 对单核苷酸的5端进行放射性标记,形成可放射显影的5-32PNp3(正常单核酸)或5-32PXNp3(含加合物的单核酸)(3)采用多维薄层色谱或者高效液相色谱将正常和含加合物的单核苷酸进行分离;(4)对分离的核苷酸加合物通过放射自显影制成指纹图,液闪计数测定加合物的含量。,B.蛋白加合物的测定最常见的为Hb（血红蛋白）加合物。因为Hb-加合物的生存期为120d左右，因而它可作为中长期暴漏的指标。最常用的方法
29、为（GC-MS法）和免疫法检测。（原理同DNA加合物的测定法）,2.一般代谢酶的活性测定A乙酰胆碱酯酶埃尔曼比色法异羟扝酸铁比色法,乙酰胆碱硫醇同类物,硫醇,DNTP,深黄色,412nm,AChE,乙酰胆碱底物,异羟扝酸铁,540nm,AChE,同位素标记法,乙酰-1-C14胆碱,AChE,乙酸-1-C14,离子交换法除去,计数器计数测量,B腺三磷酶（ATPase）钼蓝法测ATPase活性实验原理：在酸性条件下,无机磷可与钼酸铵作用生成磷钼酸铵,并被氯化亚锡还原成蓝色的磷钼蓝，由蓝色的深浅即可测定磷的含量。ATP ATPase ADP+H3PO4 H3PO4+12(NH4)MoO4+21HCl
30、(NH4)3PO412MoO3（磷钼酸铵）+21NH4Cl+12H2O(NH4)3PO412MoO3+SnCl2.H2O(MoO24MoO3)2H3PO44H2O（磷钼蓝）+SnCl4磷钼蓝的最大吸收波长为660nm.测ATPase活性时氯化亚锡可以用三氯乙酸+Vc替代,3.解毒系统酶类诱导作用的检测A混合功能氧化酶（MFO）的诱导作用直接法：测细胞色素P-450的含量间接法：测底物消耗量和产物生成量B谷胱甘肽硫转移酶（GST）活性测定,还原型谷胱甘肽（GSH）,1氯2，4二硝基苯（CDNB）,GS-CDNB,GST,340nm处被检测,4.抗氧化防御系统检测A过氧化氢酶（Ct）方法：测量释放
31、氧气量；或者用色谱法（240nm）、电化学方法和容量法滴定剩余H2O2的含量。,H2O2,H2O,O2,Ct,B谷胱甘肽过氧化酶（GPx）：清除脂类过氧化物，在Ct很少的组织，可以替代Ct的作用直接法：提纯GPx，GPx在255nm处呈最大吸收峰。此法灵敏度差。间接法：,还原型谷胱甘肽（GSH）,二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）,GS-DTNB,H2O2,H2O,GSSG,GPx,412nm处被检测,第一节 污染物的生物效应检测,生物测试及方式一般毒性试验生物的分子和细胞水平检测生物致突变、致畸和致癌效应检测微宇宙法,1.致突变试验,1.1基本概念突变（Mutation）:指细胞中的遗遗传基因发
32、生永久的、可遗传的改变。基因突变（Gene Mutation）：只涉及染色体某一部分的改变，不能用光学显微镜直接观察。染色体畸变（Chromosome Mutation）：涉及染色体数目或结构的改变，可用光学显微镜直接观察。致突变作用（Mutagenesis）：某些物质引起生物体遗传物质发生结构改变的作用。致突变物（Mutagen）：,突变的有利一面，产生新的物种。突变不利的一面，对健康存在威胁。致突变物作用于生殖细胞出现的结果：显性致死突变 遗传性疾病（色盲，随着X染色体向后代传递的；蹼趾，随着Y染色体向后代传递的）,1.2试验方法致突变试验的目的致突变试验的目的是为了检查受试物对机体是否有
33、致突变作用。致突变试验方法体外基因突变试验，例如Ames试验，哺乳动物体细胞株突变试验。细胞遗传学试验，例如，染色体畸变试验，微核试验。体内基因突变试验，例如，显性致死突变试验，果蝇伴性隐性致死试验。DNA损伤试验，例如，姐妹染色单体交换试验，DNA修复合成试验。,A.Ames试验,Ames试验原理同一种微生物的营养缺陷型突变型菌株与受试物接触，若此化学物质具有致突变性，可使突变型微生物再发生一次突变，重新成为野生型微生物。这种突变叫做回复突变。注释1：营养缺陷型突变型菌株注释2：野生型微生物,鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法原理：在动物体外将待测物经肝微粒体酶系活化后，检测其所诱发的沙
34、门氏菌回变菌落数，即由不能自行合成组氨酸的营养缺陷型突变菌株（his），回复为能自行合成组氨酸的（his）菌落数。突变率诱发回复突变菌落数/自发回复突变的菌落数（对照）当突变率大于2.0时，为阳性结果。,B微核试验原理：微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，其染色与细胞核一致，大小相当于细胞直径的l20l5，呈圆形或杏仁状，在间期细胞中可以出现一个或多个。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质(染色体断片或迟滞的染色体)。所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点，用于检测断裂剂及非整倍体
35、诱发剂。,微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分开及与核突出物相区别，故常计数多染红细胞（PCE）中的微核，因为当原成红细胞发展为红细胞时，主核排出，成为PCE，这些细胞保持其嗜碱性约24小时，然后成为正染红细胞（NCE），并进入外周血。在主核排出时，但微核仍保留于PCE细胞中。,动物选择：首选物种是小鼠和大鼠。以小鼠使用最为广泛，要求体重1820g，712周龄。每组小鼠数量10只，雌雄各半。染毒途径：根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与人体接触化学毒物相同的途径。染毒次数及取样时间：不同化学毒物诱发微核
36、出现的高峰时间也不尽相同。波动范围可以达到2472h。这就要求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。建议采用多次染毒的方法。其中以4次染毒比较方便合理。即每天染毒一次，连续4d，第5天取样。,剂量选择：受试物的最大剂量除因溶解度所限外，应达最大耐受量，或参考毒物的LD50，以80LD50为最高剂量。在一般情况下，应设45或更多试验组，剂量水平跨3个以上数量级。另设阳性和阴性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺(50100mg/Kg)或丝裂霉素C(10mg/kg)腹腔注射一次或二次。阴性对照组使用等体积的溶剂。,骨髓液的制备、涂片、固定、观察计数。PCE呈灰（淡）蓝色，NCE呈淡红色。计数200个红细
37、胞中PCE数和PCE百分比正常的PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.61.2)。如比值0.1，则表示PCE形成受到严重抑制；如比值0.05，则表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。,C.果蝇伴性隐性致死试验原理：根据隐性基因在性遗传中的交叉遗传特征，即雄蝇的X染色体传给F1代雌蝇。又通过F1代传给F2代雄蝇。位于X染色体上的隐性基因能在半合子雄蝇中表现出来。据此推断致死突变的存在。,CIB法果蝇有一个品系称l系：染色体上有一个大的倒位；隐性致死突变；显性棒眼基因。由于基因而使雄果蝇不能存活，基因可作为标记，凡带有lX染色体的雌果蝇可以从棒眼性状上加以辩认，大的倒位可以抑制lX染色体与
38、另一同源染色体交换。检测的方法是让受检的雄果蝇与l雌果蝇杂交，所生子代应为：。在雌蝇中有半数带l，可以从棒眼上加以辩认，在这些棒眼雌蝇中的两条染色体，一条是l，另一条是受检雄蝇来的染色。将这一棒眼雌性与正常雄性单对交配，观察子二代的性状。,Muller-5法（P120）Muller-5品系，是人工创造的一个果蝇品系。它的X染色体上带一个棒眼基因B，一个杏色眼w和一个倒位区段。倒位区段的存在可以抑制杂合体的交换重组。用经诱变处理的雄蝇，与Muller-5品系雄蝇杂交，得到子一代后再做单对交配，看F2代的分离情况。如有致死突变，子二代中没有野生型雄蝇，如有隐性的形态突变，则除Muller-5雄蝇外
39、，还可出现具有突变性状的雄蝇。,D.姐妹染色单体交换试验姊妹染色单体交换（Sister chromatial exchange,SCE）是染色体同源座位上复制产物间的相互交换，是同一染色体的两条单体之间发生的一类特殊的同源重组，主要在DNA合成期形成，可能与DNA双链的断裂与复制有关，SCE的发生的频率可反映细胞在S期的受损程度。如果一个个体的SCE率明显增高，可表明染色体受到环境中的一定因素的影响，或是受到遗传缺陷的内在制约因素所致。,在细胞分裂时，每条染色体均有两条染色单体组成，每条染色单体有一条双链DNA组成。5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxy-uridine，BrdU）是脱
40、氧胸腺嘧啶核苷的类似物，在DNA链的复制过程中，可替代胸腺嘧啶。当细胞生存环境中存在BrdU时，BrdU取代脱氧胸苷掺入到复制的DNA中。经两个复制周期后，两条姊妹染色单体中一条DNA的双链均有BrdU掺入，而另一条DNA双链中仅有一条链有BrdU掺入。,利用特殊的分化染色技术对染色体标本进行处理，可使双链均含有BrdU掺入的单体浅染，而只有一条链掺入BrdU的单体深染。当姊妹染色体间存在同源片段交换时，可根据每条单体夹杂着深浅不一的着色片段加以区分。由于姐妹染色单体的DNA序列相同，SCE并不改变遗传物质组成，但SCE是由于染色体发生断裂和重接而产生的，因此，SCE显示方法通常用来检测染色体
41、断裂频率，用来研究药物和环境因素的致畸效应。,试验步骤：,1）按半微量法采取外周静脉血，细胞培养24h后于培养液中加入Brdu和待测产物，最终浓度10g/ml，避光条件下继续培养。（2）待细胞经历两个细胞周期（48h），培养终止前4h加秋水仙素，秋水仙素终浓度为0.02g/ml培养液；（3）常规制片，染色体制片在37恒温箱内老化24h；（4）紫外灯照射：取标本玻片置于大号培养皿内，正面朝上，上覆盖镜头纸，从玻片外镜头纸边沿加2SSC液致使全镜头纸浸湿，移入60水浴锅内，紫外线灯距离5cm，照射30min；（5）染色：取出照射后标本，蒸馏水冲洗，置pH6.8的2%Giemsa染色10min。,2
42、 致畸效应,2.1概念畸形（Malformation）:由于受到某些因素的影响，使胚胎的细胞分化和器官形成不能正常进行，造成器官组织上的缺陷，并出现肉眼可见的形态结构异常者。畸胎（Terate）:畸形的胚胎。致畸作用（Teratogenesis）:通过母体作用于胚胎而引起胎儿畸形的现象。致畸物（Teratogen）:引起胚胎发育障碍而导致胎儿发生畸形的物质。,2.2致畸作用的毒理学特点胚胎与致畸物接触时因胚胎处于不同的发育阶段而呈现不同的敏感性。一般器官形成期比较敏感。种属差异较为明显。代谢不同、胎盘构造不同、遗传机理不同。致畸作用的剂量-反应曲线较为陡峭 最大无作用剂量与100%致畸剂量之间
43、距离较小，一般相差1倍，曲线斜率也较大，亦即致畸带较为狭小。,本图所示安全范围为95%的药效剂量与5%毒效剂量,2.3化学致畸作用机理突变引起胚胎发育异常；甲醛、克菌丹。对细胞的生长分化较为重要的酶类受到抑制；核糖核苷酸还原酶、DNA聚合酶、二叶酸还原酶、碳酸酐酶。母体正常代谢过程被破坏，使子代细胞在生物合成过程中缺乏必需的物质，影响正常发育，出现生长迟缓或畸形。细胞分裂过程的障碍，致畸物可干扰细胞的分裂过程，引起生殖细胞减数分裂中的不分离或细胞有丝分裂过程的障碍。,2.4致畸试验致畸试验的目的检测环境污染物能否通过妊娠母体引起胚胎畸形。受试动物：一般试验动物要求其对化学物质的代谢过程与人相似
44、，胎盘结构也相似，还要求孕期短，产仔多，经济实用，如家兔、大鼠、小鼠等。,步骤简述：分组：常用大鼠或小鼠，性成熟的试验动物进行交配，以雌鼠阴道发现阴栓或涂片发现精子为受孕0天，将孕鼠随机分组。通常设3个剂量组和1个对照组，每组20只孕鼠。剂量设置：高剂量组应使母鼠产生明显的毒性反应，但母体死亡率不应超过10%；低剂量组应无明显的毒性反应。于胚胎发育的器官形成期（大鼠为受孕第6-15日，小鼠为受孕第5-14日）给以受试物。检测：于自然分娩前1-2日，剖腹取出子宫内胎仔，记录活胎、死胎及吸收数，检查活胎仔的外观、骨骼及内脏畸形。,结果评价：致畸指数=雌鼠LD50/最小致畸剂量致畸指数10以下为不致
45、畸，10100为致畸，100以上为强致畸。为表示有害物对人体危害的大小，可计算致畸危害指数，如指数大于300说明受试物对人危害小，100300为中等，小于100为危害大。致畸危害系数=最大不能致畸剂量/最大可能摄入量。,2.5致畸作用的评价注意与自然变异区分；注意种属差异；注意试验的阈剂量与人类实际可能摄入量之间的差别。（维生素A）,3 致癌效应 癌，一种恶性肿瘤。发生于人与动物体组织，器官的细胞无限制增生，导致对附近正常组织的压挤，侵犯和毁坏。增生的癌细胞可由血液和淋巴带至身体其他部位进行增殖与破坏。据估计，人类肿瘤有8090%与环境因素有关系，其中化学因素占8085%。六个致癌习惯,A、卫
46、生纸：引发白血病卫生纸添加了染料，包括荧光增白剂或滑石粉，添加剂多含有化合物苯；有些质量欠佳的卫生纸，还含有甲醛、大肠杆菌、肝炎病毒等。这些物质长期与皮肤接触可能引发白血病和癌症。B、清香剂：诱发白血病清香剂的香味也是化学合成物，也可能诱发癌变。多数家庭都使用消毒水等清洁用品，它们蒸发后，往往会积聚大量有害气体。某些消毒水还含二氯苯，会刺激呼吸道，使细胞变异而诱发白血病、肺癌等。C、塑料纸篓厕所里放纸篓会大大增加细菌繁殖的速度，使卫生间变成病毒繁殖场和传染源。,D、洗发水洗发水一旦被长期打开储存的话，其中的甲醛就会与洗发水中使用的乳化成分一起产生化学反应，形成一种叫做“N-亚硝基二乙醇胺”的致
47、癌物质。E、泡泡浴 泡泡浴中使用的泡沫剂，很香，但这香味剂可能会导致皮肤发炎、头晕；长时间躺在浴缸中令身体接触泡沫剂，其含有的有害化学成分“泡沫稳定剂”会渗透到皮肤和呼吸到肺中。、牙膏：牙膏过多使用或致口腔癌，牙龈疾病会诱发心脏病牙膏中广泛使用的化学物质“月桂醇硫酸钠”被认为可能会导致肠胃病和肝中毒；会令口腔更容易溃烂，患口腔癌。牙膏中的研磨剂也被认为会伤害牙龈，令牙龈更易受到侵害。,3.1概念化学致癌作用（Chemical Carcinogenesis）：化学物质引起肿瘤的过程。化学致癌物（Chemical Carcinogen）：能诱发肿瘤的物质。化学致癌物的特点：生物学上的持久性和迟发性
48、；多次给予受试物比一次效应大；从机理上看，一般都和宿主细胞的遗传物质或其他大分子的相互作用有关系。,3.2细胞癌变学说 体细胞突变学说：致癌因素作用于体细胞的遗传物质DNA，使其发生突变，使细胞的功能发生障碍而致癌。分化障碍学说：细胞癌变不一定要体细胞遗传物质发生突变，细胞分化过程中有关的基因调控过程受到致癌因素的干扰，使细胞分化和增殖发生紊乱而癌变。癌基因学说：所有细胞DNA分子中都存在着癌基因的遗传信息，在正常状态下，这种癌基因处于阻碍状态，只有细胞内的有关调节因子遭到破坏的情况下，癌基因才能表达，从而导致细胞发生癌变，形成肿瘤。,3.3癌变过程引发阶段：体细胞突变，避免机体的正常修复和免
49、疫监视。促进阶段：临床上可被检测出肿块浸润和转移阶段：侵害周围的正常组织或者扩散到体内其他部位。,3.4致癌试验致癌试验是检验受试物及其代谢产物是否具有致癌效应或诱发肿瘤作用的慢性毒性试验法。利用完整的动物进行长期试验，目前是致癌试验的重要方法。短期筛检方法：致突变试验,长期动物诱癌试验，步骤如下：A.动物选择：选用大鼠和小鼠。B.剂量选择和动物数量设三个试验组。以最大耐受剂量（MTD）为高剂量。使动物体重减轻不超过对照组的10，并且不引起死亡及导致缩短寿命。每组至少有雌雄各50只动物，共100只。在出现第一个肿瘤时，每组还应有不少于50只动物。,C染毒途径和试验期限：原则上试验期限要求长期或
50、终生，一般小鼠1.5年，大鼠2年。D.观察、结果的分析和评定观察有无肿瘤出现、肿瘤出现时间及死亡时间。统计各种肿瘤的病理学诊断和数量、患肿瘤的动物数、每只动物的肿瘤数及肿瘤潜伏期。肿瘤发生率（）（实验结束时患肿瘤动物总数有效动物总数）100，有效动物总数指最早发现肿瘤时存活动物总数。两个物种两种性别动物中，有一种结果为阳性，即认为有致癌性。两个物种两种性别动物试验结果均为阴性时，方能认为未观察到致癌作用。阳性评定标准（p131）,第一节 污染物的生物效应检测,生物测试及方式一般毒性试验生物的分子和细胞水平检测生物致突变、致畸和致癌效应检测微宇宙法,1.微宇宙（Microcosm）是研究污染物在
