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1、生物化学实用技术 章宇宁,项目二 蛋白质,蛋白质的研究历史,18世纪初，人们认识到一类“动物物质”的存在，认为这一类的物质组成了动物（包括人）的身体中柔软的部分18世纪末，科学家证明这类物质中含有氮1838年，科学家正式将这类物质定名为“protein”该词来自希腊语，有“最重要”的意义,蛋白质的研究历史,科学家对蛋白质的直观认识早于氨基酸1806年第一个氨基酸被发现，但直到1920年，科学家才区别了必需氨基酸和非必需氨基酸，揭示了氨基酸和蛋白质之间的关系：蛋白质是由氨基酸构成的,蛋白质的化学组成,蛋白质是由氨基酸构成的氨基酸中都含有_组成蛋白质的主要元素是_，有些蛋白质还含有一定量的_。_元
2、素的含量在各种蛋白质中很接近，平均为_。这是蛋白质元素组成的特点，也是测定蛋白质含量的依据之一。,凯氏定氮法,在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。,三聚氰胺奶和“皮革奶”,三聚氰胺（Melamine）（化学式：C3H6N6），俗称蛋白精，IUPAC命名为“1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨基”，被用作化工原料。它无色，几乎无味，微溶于水（3.1g/L常温），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚类。对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。,
3、三聚氰胺中的氮不是来自于蛋白质，可以通过其他技术检测“非蛋白氮”进行定量。,三聚氰胺奶和“皮革奶”,在皮革行业中，会有一些下脚料。它们是没有用的废料，但含有大量胶原蛋白。用这样的废料来生产“水解胶原蛋白”，成本非常低由于加工过程的卫生条件差、有毒重金属残留，造成严重危害，“皮革奶”的检测并不困难。胶原蛋白中有大量的羟基脯氨酸，而牛奶蛋白中并不含有；牛奶蛋白中有一定量的色氨酸，而胶原蛋白中并不含有。,蛋白质的分类,按分子形状分类球状蛋白纤维状蛋白按分子组成分类简单蛋白：无 非蛋白成分 可进一步按溶解度分类结合蛋白：蛋白质非蛋白成分 可进一步按辅基分类,蛋白质的分类,简单蛋白按溶解度分类,蛋白质的
4、分类,结合蛋白按辅基分类,氨基酸如何形成蛋白质？,如何“串起”氨基酸？,氨基酸如何形成蛋白质？,氨基酸脱水缩合形成肽,作业一：抄写氨基酸脱水缩合形成肽的方程式,氨基酸如何形成蛋白质？,肽键：不能自由旋转，C、N、O、H及两边的C原子6个原子共平面，称为“酰胺面”，影响蛋白质结构两个氨基酸相连就叫做二肽二肽的两端可以继续和其他氨基酸反应，形成三肽、四肽、五肽少于10个氨基酸的肽叫寡肽，多于10个氨基酸的肽叫多肽某些小肽具有特别的生物活性,肽及肽键,氨基酸残基,蛋白质的理化性质,物理性质千差万别由氨基酸组成，保留了氨基酸的一些化学性质具有本身的独特性质,蛋白质的理化性质,两性性质及等电点 胶体性质
5、 沉淀作用 颜色反应 紫外吸收性质,蛋白质的两性性质及等电点,蛋白质的等电点：蛋白质所带净电荷为零时，所处溶液的pH 值即为该蛋白质的等电点。,等电点与等离子点,中性盐的存在常导致蛋白质的等电点发生明显的改变实际测得的等电点与介质的离子组成有关在不含任何盐的纯水中测得的等电点称为蛋白质的等离子点，是蛋白质的特征常数,蛋白质的胶体性质,蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如不能通过半透膜等。常用透析法分离纯化蛋白质,稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：蛋白质表面极性基团形成的水膜(水化层)将蛋白质颗粒彼此隔开，阻止其相互聚集而沉淀蛋白质颗粒在非等电状态下，带同种电荷，互相排斥，不致聚集而沉淀,蛋白质的沉
6、淀作用,1、定义：蛋白质的水膜或电荷一旦除去，蛋白质就会从溶液中沉淀下来2、分类：可逆沉淀：在沉淀过程中，蛋白质的结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液。不可逆沉淀：在沉淀过程中，蛋白质的结构和性质都发生了变化，沉淀不可能再重新溶解于水,作业二：使蛋白质可逆沉淀和不可逆沉淀的常用方法都有哪些？,可逆沉淀蛋白质的常用方法：,盐析法(中性盐沉淀法),盐析法(中性盐沉淀法)：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐,使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。常用中性盐有(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。,盐溶：向蛋白质水溶液中加入少量的中性盐，增加蛋白质表面的电荷，增强了蛋白质与水的作
7、用，从而导致蛋白质在水中的溶解度增大,有机溶剂沉淀法：常用与水互溶的有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等，破坏水膜，使其沉淀。,重金属盐沉淀法常用重金属盐有Hg2+盐、Pb2+盐、Cu2+盐等生物碱试剂沉淀法常用生物碱试剂如单宁酸、苦味酸、钨酸等,不可逆沉淀蛋白质的常用方法：,蛋白质的颜色反应,反应 试剂 颜色 反应基团双缩脲反应 NaOH,稀CuSO4 紫红 2个或2个以上肽键Folin酚试剂反应 CuSO4磷钨酸-钼酸 兰色 酚基茚三酮反应 茚三酮 兰紫色 游离氨基 Millon反应 Millon试剂 红色 酚基黄色反应 HNO3及NH3 黄、橘黄 苯环乙醛酸反应 乙醛酸，H2SO4 紫红 色氨酸
8、吲哚基坂口反应 次氯酸钠,萘酚,NaOH 红色 精氨酸的胍基,双缩脲反应,蛋白质也有类似反应,红紫色络合物,(碱性溶液),Cu2+,蛋白质的紫外吸收,大部分蛋白质均含有芳香族氨基酸。_、_、_芳香族氨基酸在280nm 附近有最大吸收，绝大多数蛋白质也有同样的性质。可以对蛋白质进行定性定量测定。,蛋白质的结构,蛋白质的结构,基本结构：一级结构三维结构：高级结构 二级结构 超二级结构 结构域 三级结构 四级结构一级结构决定高级结构，高级结构决定功能,蛋白质的结构,蛋白质的一级结构,1、定义：指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序和连接方式，它是实现蛋白质空间结构及其功能的基础，又称为蛋白质的化学结构、共价
9、结构、初级结构,作业三：蛋白质一级结构的定义是什么？,蛋白质一级结构举例,牛胰核糖核酸酶50年代末Moore等,牛胰岛素1953年sanger等,确定蛋白质一级结构的方法,将肽链部分水解，生成的碎片（二肽、三肽等）用末端残基分析法加以测定。当有足够的小碎片被鉴定后，就有可能求出整个链中残基的顺序了。,蛋白质的二级结构,1、定义：指蛋白质多肽链主链的空间走向（折叠和盘绕方式）2、四种二级结构单元-螺旋-折叠-转角 不规则卷曲,作业四：常见的蛋白质二级结构有哪几种？,-螺旋,俯视图,侧视图,-螺旋的特征要点：,有右手螺旋及左手螺旋两种，天然蛋白质中的-螺旋几乎都是右手螺旋，右手螺旋比左手的稳定稳定
10、性是靠链内氢键维持的，肽链上C=O氧与它后面第4个残基上的N-H氢之间形成氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行,每圈螺旋高度为0.54nm，含3.6个氨基酸残基；每个氨基酸残基绕轴旋转100，沿轴上升0.15nm氨基酸残基的R侧链在螺旋的外侧，其形状、大小及电荷等均影响-螺旋的形成,-折叠,定义：两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，靠链间氢键联结的片层结构,折叠的特征要点：,相邻肽链走向可平行也可反平行。肽链的N-端在同侧为平行式，不在同侧为反平行式。从能量角度考虑反平行式更为稳定 稳定性是靠链间氢键维持的，氢键是由相邻肽链主链上的N-H和C=O之间形成的氨基酸残基的R侧链交替分布在片层
11、的上下两侧,-转角(-回折、-弯曲、发夹结构),定义：是蛋白质分子中出现的180回折。,-转角的特征要点：,主链骨架以180返回折叠由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成，第1个氨基酸残基的C=O与第4个氨基酸残基的N-H之间生成氢键广泛存在于球状蛋白质中，多数由亲水氨基酸残基组成,无规则卷曲,定义：没有规律的多肽链主链骨架构象此结构看来杂乱无章，但对一种特定蛋白又是确定的，而不是随意的。酶的活性中心往往在无规则卷曲中。,1.4.4 超二级结构：,若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则，在空间上能辨认的二级结构组合体。,1.4.5 结构域：多肽链上由相邻的超二级结构单元联系而成
12、的局部性区域，多肽链折叠成近乎球状的高级结构。,补充：,1.4.6 蛋白质的三级结构,定义：建立在二级结构、超二级结构乃至结构域的基础上，一条多肽链中所有氨基酸残基的空间关系（构象）。,举例：肌红蛋白,肌红蛋白1条多肽链1个血红素辅基,结构域三级结构,？,对于小分子蛋白质来说，结构域就是其三级结构；大分子蛋白质则是由两个或两个以上相对独立的三维实体（结构域）缔合而成的。,典型例子：免疫球蛋白,木瓜蛋白酶内的2个结构域,彼此很不相同,弹性蛋白酶的二个结构域,彼此非常相似,蛋白质的四级结构,1、定义：由两条或两条以上各自独立具有三级结构的多肽链通过次级键相互缔合而成的蛋白质结构,四级结构只存在于具
13、有两条或以上肽链组成的蛋白质中。亚基（亚单位）：四级结构的蛋白质中每一个球状蛋白。单体蛋白质：只有一个亚基（三级结构）寡聚蛋白质：由少量亚基组成的蛋白质，如四聚体血红蛋白 多聚蛋白质：由大量亚基组成的蛋白质,举例：血红蛋白,维系蛋白质分子结构的作用力,共价键：肽键、二硫键非共价键：氢键、离子键、疏水键、范德华力,二硫键(二硫桥),是由两个半胱氨酸侧链的巯基SH脱氢而形成的。二硫键用于稳定蛋白质的三、四级高级构象。,氢键,多肽链中侧链间或侧链与主链骨架间所生成的氢键是维持蛋白质三、四级结构所需的,多肽链中主链骨架中的氢键是维持蛋白质二级结构主要的次级键,疏水键(疏水作用力),蛋白质中的疏水氨基酸残基避开水分子而聚集在分子内部的趋向力。它是维持蛋白质分子三、四级结构最主要的作用力。,离子键(盐键),正、负电荷的侧链基团之间的一种静电吸引作用。,范德华力,中性分子或中性原子之间弱的作用力，参与维持蛋白质分子三、四级结构,作业五维持蛋白质一四级结构的主要作用力分别是什么？,
