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1、桑国俊,甘肃省畜牧兽医研究所,牛卵母细胞及体外胚培养技术研究,一 发展背景二 试验内容三 结果与分析四 总结,3,一 发展背景,随着胚胎工程技术的深入研究和商业性胚胎移植技术的发展，胚胎需求量日益增加，单纯依靠超数排卵获得体内胚的方法成本高、采胚数量有限，不能满足科研和生产的需要。卵母细胞体外胚生产体系的建立将成为胚胎生产的主要突破点。深入研究卵母细胞体外胚及其冷冻保存的技术机理，建立一套完全在体外培养条件下快速生产和保存胚胎的技术体系，挖掘优良母畜的繁殖潜力，具有巨大的科研价值与现实意义,5,牛胚胎体外生产技术的累积效率低、技术复杂、实验条件高，受培养基、卵泡液、共培养细胞等因素影响大，还缺
2、乏统一的理论依据和程序化的标准方案，仍处于探索阶段。因此，还必须不断改进和完善胚胎体外培养和生产体系,6,二 试验内容,7,试验内容技术路线,种公牛,鲜精,冻精,洗涤、离心,精子获能,母牛,超排,卵巢采卵,IVM,IVF,IVC,桑、囊胚,COCs,8,试验内容试验设计1 卵母细胞体外成熟培养1.1 COCs级别对卵母细胞成熟的影响1.2 卵泡直径对卵母细胞成熟的影响2 卵母细胞体外受精2.1 不同离心方法对精子获能和卵母细胞受精的影响2.2 不同上浮方法对精子获能和卵母细胞受精的影响2.3 精子浓度对卵母细胞受精的影响,9,3 胚胎体外培养3.1 共培养体系对胚胎发育的影响3.2 培养液体积
3、对胚胎发育的影响4 冷冻保存COCs的培养4.1 GL和EG一步法冷冻对COCs的影响4.2 麦管和OPS管玻璃化冷冻对COCs的影响SPSS统计分析,10,三 结果与分析,11,1 卵母细胞体外成熟培养 1.1 COCs级别对卵母细胞成熟的影响选择A、B级COCs进行成熟培养,C 级COCs,12,1.2 卵泡直径对卵母细胞成熟的影响卵母细胞的成熟率与卵泡直径关系密切，在卵母细胞体外培养过程中，宜选择卵巢发育正常的卵泡采集，而不宜选择发育过大或过小的边际卵泡,13,2 卵母细胞体外受精 2.1不同离心法对精子获能和卵母细胞受精的影响二次离心沉淀液：精子活力0.44；获能效果10min最高为0
4、.41，15min为0.32，超活化以15min时最好；受精率为40.19%二次离心上清液：精子活力0.56；获能效果10min最高0.59，15min时较低为0.585，超活化也以15min时最好；受精率为43.21%,14,从试验结果看，宜选用上清液15min组的获能精子进行体外受精。本试验突破了精子离心法的传统方法，避开了单纯利用沉淀液进行精子获能的思路，而直接对上清液进行离心处理，获得了理想的精子洗涤和获能效果,精子获能活 力超活化效果,15,2.2 不同温度上浮法对精子获能和卵母细胞受精的影响室温上浮法：2024室温。上浮60min，45min活力最高0.68，对其获能15min后进
5、行体外受精，平均受精率41.40%,16,恒温上浮法：CO2培养箱（38.5）上浮60min，30min活力最高0.697，对其获能15min体外受精，受精率41.51%,17,二种不同上浮方法的精子活力和受精率之间差异不显著（p0.05），恒温上浮法的效果略高于室温组。室温随着季节和气候变化而变化，始终处于不稳定状态，精子活力升降比较零乱，而恒温上浮的条件稳定，精子活力升降序列比较整齐，在本试验中的优势虽不明显，如从可控角度考虑，还以恒温上浮法为宜 培养液表.xls,受精率,获能方法与卵母细胞受精率,18,2.3 精子浓度对卵母细胞受精的影响本试验表明精子适宜浓度宜控制在1.01.5106个
6、/ml,19,3 胚胎体外培养3.1 卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养系统对胚胎发育的影响,20,卵母细胞体外胚的发育受到多种因素的影响，培养过程中要摸拟卵母细胞或胚胎在子宫中的条件，给细胞发育创造良好的环境。卵母细胞体外受精过程中明显存在发育阻滞，克服发育阻滞的主要手段是用共培养系统提高卵裂率和桑、囊胚发育率。本试验通过添加共培养物质，较好地克服了体外胚的发育阻滞,21,3.2 培养液体积对胚胎发育的影响,22,大体积培养液培养的体外胚、桑、囊胚率均较高于微滴培养胚胎培养液的体积与培养系统的稳定性和液体蒸发有关。培养液量小，胚胎平衡培养的微环境差，培养环境易随外围环境的变化而改变；培养液体积
7、过大，胚胎及细胞分泌的生长因子浓度降低，不能有效地促进胚胎正常发育,23,4 冷冻保存COCs的解冻培养4.1 GL和EG一步法冷冻对COCs的影响COCs在液氮保存1周后解冻成熟培养冷冻保护剂GL和EG均可用于COCs的冷冻保存（p0.05），但EG的效果比较好,24,成熟率,桑椹胚率,囊胚率,25,4.2 麦管和OPS管玻璃化冷冻对COCs的影响以麦管和OPS管作为冷冻载体，二步法玻璃化冷冻COCs。对冷冻1周后的COCs解冻培养OPS管玻璃化冷冻的效果优于麦管法（p0.05），而麦管法宜于操作和储存，宜在实际操作中选用麦管法,26,成熟率,桑椹胚率,囊胚率,27,4.3 COCs冷冻方法
8、的比较COCs的4种处理方法在成熟培养、桑椹胚发育和囊胚发育方面的趋势基本一致，整体效果的优势序列为EG法GL法OPS管法麦管法玻璃化冷冻效果低于程序化一步法冷冻法。由于玻璃化冷冻的解冻处理程序复杂，建议实际应用时选用麦管程序化一步法冷冻法,28,四 总结,29,1 COCs级别 选择A、B级COCs进行卵母细胞成熟培养 2 卵泡大小 选择直径28mm卵泡的COCs进行卵母细胞成熟培养3 离心法精子获能 对第一次离心上清液继续进行低速离心处理，可获得更好的精子洗涤和获能效果。低速离心4 上浮法精子获能 选用恒温上浮法进行精子洗涤和获能 5 获能精子浓度 用于体外受精的适宜精子浓度为1.01.5
9、106个/ml6 共培养系统 卵丘细胞+bFF 共培养系统能显著促进体外胚的发育,30,7 培养液体积 大体积培养液培养的桑、囊胚率均较高于微滴培养，大体积培养液更有利于胚胎发育8 冷冻COCs解冻培养 冷冻保护剂EG和GL对COCs有良好的冷冻保存作用，EG效果比GL更好 OPS管玻璃化冷冻效果优于麦管法，麦管法宜于操作和储存，建议在实际操作中选用麦管法 程序化一步法冷冻COCs的效果优于玻璃化冷冻法,31,1 卵母细胞及体外胚培养：选择28mm卵泡的A、B级COCs，清选后移入500l成熟培养液中培养24h；拣取成熟良好卵母细胞，用上清液二次离心法或恒温上浮法清选和获能的精液体外授精8h，在加入卵丘细胞和bFF的IVC液中继续培养120140h，拣取桑椹胚和囊胚2 卵母细胞的冷冻保存：选择28mm卵泡A、B级COCs，用以EG为冷冻保护剂的麦管程序化一步法进行冷冻保存3 冷冻卵母细胞的解冻培养：冷冻卵母细胞解冻后，拣取卵丘细胞完整的COCs按照正常卵母细胞进行培养,根据以上试验结果，卵母细胞培养、体外胚培养、卵母细胞冻存和解冻培养的操作程序概括为：,32,主要创新点,1 系统研究了牛卵母细胞体外培养技术，突破发育阻滞，将卵母细胞体外培养到桑、囊胚2 对卵母细胞进行冷冻保存，探索了COCs的冷冻方法，并对冷冻效果进行了评定3 建立了新的精子洗涤和获能方法,33,谢谢,
