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1、一、色谱法,色谱法：又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法。它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。,叶绿体色素纸层析分离实验（纸色谱）,1906年，俄国植物学家茨威特分离植物叶绿体中色素而得名，玻璃管中装CaCO3,石油醚溶解植物叶绿体倒入管内，再用石油醚做淋洗剂，结果，柱子中被分成几个不同颜色的谱带。,二、柱色谱,柱色谱（Column chromatography)为向玻璃管中填入固定相，以流动相溶剂浸润后在上方倒入待分离的溶液，再滴加流动相，因为待分离物质对固定相的吸附力
2、不同，吸附力大的固着不动或移动缓慢，吸附力小的被流动相溶剂洗下来随流动相向下流动，从而实现分离。,三、色谱法的分类方法很多，最粗的分类是根据流动相的状态将色谱法分成四大类。色谱法按流动相种类的分类：,四、气相色谱法（GC法）,（一）原理 气相色谱法是采用气体作为流动相的一种色谱法。此法中，载气（是不与被测物质作用，用来载送试样的惰性气体。如氢、氮气）。载着被分离的试样通过色谱柱中的固定相，使试样各组分分离，然后检测。流动相气体（由载气带着物料气体）一般用高压气瓶供给（N2、He)固定相 固体 固体吸附剂 液体担体+固定液,担体：是一种化学惰性的多孔性固体颗粒。它的作用是提供一个大的惰性表面，用
3、于承担固定液，使固定液以液蜡的状态均匀地分布在其表面。,实现色谱分离的先决条件是必须又固定相和流动相。色谱柱：在色谱分析法中，内有固定相以分离混合组分的柱子（或玻璃管）。固定相：色谱柱内不能移动的，起分离作用的物质；流动相：在色谱柱中用于携带试样和洗脱组分的物质,不同的物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数;当两项作相对运动时，这些物质也随流动相一起运动，并在两项间进行反复多次的分配;这样就使在同一固定相上分配系数只有微小差别的组分，在固定相的移动速度发生了很大的差别，从而达到各组分的完全分离。,(二）气相色谱流程示意图：,可见261页,（三）气相色谱仪,1、气相色谱仪的主要部件
4、气相色谱仪可分为气路系统、进样系统、分离系统、检定器、放大记录系 统五个部分。（1）气路系统：是一个载气连续运行的密闭管路系统。从气源出来的载气顺次经过减压阀、压力表、净化器、气流调节器、转子流量计、汽化室、色谱柱、检测器，然后放空。,（2）进样系统包括进样装置和汽化室。液体进样用微量注射器，汽化室的作用是将液体或固体样品瞬间汽化为蒸汽。,（3）分离系统：是装在恒温箱内的色谱柱。他是气相色谱中的核心部分。色谱柱中装有固定相。,（4）放大系统：将检测器转换来的微弱电信号放大记录的系统。（5）检测器：是关键部件。作用：将经色谱柱分离后的各组分按其特性及含量转换为相应的电信号。按其测定原理不同分为浓
5、度型检测器和质量型检测器。,2、色谱图：样品中各组分经色谱过程后，按先后次序进入检测器，检测器就将流动相中各组分的浓度(或质量)的变化，转变成电压(或电流)，由记录器记录下来，即得 到以组分浓度(或质量)变化为纵坐标，流出时间为横坐标的信号时间曲线，称为色谱图。,tR,t0,从记录仪得到的色谱图,3、气相色谱流出曲线有关术语保留时间从进样到出现组分浓度极大点（色谱峰最高点）的时间tR 在一定固定相，一定操作条件下，各组分的 t 值不一样。同一组分有同样的 t 值，可用来作定性分析。此外，峰高（h）、峰面积（A）可用作定量分析。,A=h 半宽度（峰高一半处色谱峰宽度）A=（底高）2 A 值=积分
6、仪求得总面积的 94。计算（一组分峰面积94）（总峰面积94）以标准曲线来计算含量，以含量为横坐标，峰面积为纵坐标。,层析柱和检测器 1.检测器有多种 热导池检测器（TCD）在气相色谱中应用最早、最广泛的检测器。灵敏度为100 ppm。原理：不同组分和载气有不同的导热系数。当通过热导池的气体组成及浓度发生变化时，可引起热敏元件上温度的变化，由此而产生阻值变化，可衡量组分的含量。,氢火焰离子化检测器（FID）灵敏度比热导池检测器高1000倍，可在室温至300范围内使用。原理：以H2（燃烧气）和空气（助燃气）的火焰为能源，在氢火焰附近装置两个电极（收集极、发射极），两个电极之间外加100350V电
7、压，当样品组分从色谱柱馏出后，由载气携带，与H2汇合，从喷嘴流出，与空气相遇，经引燃就燃烧。在氢火焰高温能源作用下，样品组分、电离成正、负离子，,在直流电场的作用下，离子向电极移动产生电流，这微小的电流经放大器放大后输入记录器，得出色谱峰信号。氢焰检测器（与单位时间内进入火焰组分的质量成正比，是典型的质量型检测器）对大多数有机物都很灵敏。但对在氢火焰中不电离的或电离很少的物质如N2、NO、CO、CO2、SO2、NH3、H2O、SiCl4、SiF4、HCN等，及无机物不能用这种检测器。,电子捕获鉴定器（ECD）是一种具有选择性和灵敏度很高的色谱检测器。放射源以同位素Ni63和3H为射线放射源，将
8、载气电离产生正离子和慢速低能量的电子，他们在恒定的电场作用下向极性相反的电极移动形成恒定的电流基始电流。当具有电负性的组分进入检测器时，它捕获了电子，变成带负电离子，并与载气产生的正离子结合成中性化合物，被载气带出检测器，结果使基始电流降低产生信号，形成峰值。,这种检测器是对具有电负性的物质（如含有卤素、S、P、N的物质）产生信号，且电负性越强，产生的灵敏度越高，有机氯农药含有卤素 Cl，所以非常适合。也属浓度型检测器。另外还有火焰光度检测器（FPD）测含S、P化合物，在氢火焰中燃烧测其中发光情况。,2.层析柱（色谱柱）直径 2 3 mm，长 1 2 m，特殊的达十几米，玻璃、尼龙、金属有机氯
9、在高温下易挂壁，产生催化分解和吸附现象，干扰分析。气液色谱固定相：担体+固定液。要求：担体 化学惰性，与溶质之间不起任何化 学作用。买来后往往要自己处理，经酸洗 水洗至中性，干燥后在硅烷化处理。固定液 常用OV系列，可在350下使用，热稳定性好等，都属硅酮类含甲基、氟等）。要让固定液很好的涂在但体上。,气相色谱分析法操作条件的选择,(1)载气及其流速的选择 载气种类的选择一方面要考虑检测器的适应性,当用热导检测器时常用N2,H2,He作载气,当用氢火焰离子化检测器,火焰光度检测器和电子捕获检测器时常用N2作载气.另一方面要考虑载气流速对分离时间和分离效率的影响,当柱和组分一定时,最佳流速可用色
10、谱学中范氏方程计算,但在最佳流速下柱效最高而分析时间较长,实际操作时载气流速常高于最佳流速.合适的载气流速常需通过条件实验来确定.,(2)柱操作温度的选择 柱温直接影响分离效率和分析速度.较高的柱温能降低气相,液相的传质阻力,有利于提高柱效,缩短分析时间,但使选择性相应降低;较低的柱温会使分析时间延长.可通过条件实验来选择最佳柱温,其原则是:既保证各物质能达到良好分离,又不会使峰形扩散,拖尾,同时还要保证能在较短时间内完成分离对于高沸点混合物(300400),使用固定液含量低于 3%的色谱,柱和高灵敏度检测器时,柱温一般控制在200230;中等沸点混合物(200230),固定液含量宜控制在 5
11、%10%,选择中等柱温(150180)即可;对低沸点混合物(100200),固定液含量宜控制在10%115%,柱温则在70120即可;对于气体,气态烃类混合物,固定液含量宜控制在15%25%,在室温或50以下即可.,(3)进样量的选择 气化室温度,柱容量和检测器的线性响应范围决定进样量.对进样量的要求是:样品能瞬间气化,分离效果良好并在检测器线性响应范围之内.一般液体试样进样量控制在0.110L,气体试样进样量为0.110mL.进样速度越快越好.,气相色谱仪的操作,(一)基本操作1、气体钢瓶的正确使用：钢瓶气由气体厂提供，其纯度可分为普级和高纯级。前者纯度为99.9%以上，后者纯度为99.99
12、%以上。填充柱气相色谱一般使用普级即可满足要求，毛细管柱气相色谱则最好用高纯级气体作载气。气瓶颜色：氢气为绿底红字，氮气为黑底黄字，压缩空气为黑底白字。瓶上注明了纯级。载气纯度不不符合要求，会使基线不稳噪声增大。,（一）基本操作,钢瓶的瓶嘴上有一阀瓣开关。用8号扳手顺时针方向旋转为关闭，逆时针旋转为开启，在瓶嘴上安装减压表才能开启钢瓶。,2、减压表的安装与正确使用,气相色谱仪使用的各种气体压力为o.2O.5MPa，因此需要通过减压表使钢瓶 气源的输出压力下降。减压表一般分为氢气表和氮气表(氧气表)两种。氮气表可以安装除了氢、乙快和其它燃气瓶以外的各种气瓶上。两种减压表的区别是，氢气表和氮气钢瓶
13、是反扣螺纹，逆时针方向旋紧，顺时针方向松开;而氮气表和氮气瓶 嘴及其他气体都是正扣螺纹。,减压表装有两个弹簧压力表，分别指示钢瓶内和减压后的气体压力。减压后的气体压力可由T阀杆调节。顺时针方向旋转增加出口压力，逆时针旋转则相反。,在每次开启钢瓶阀瓣之前应先检查T形阀杆是否处于放松(关闭出口)位置。如果T形阀杆处于开启位置就开钢瓶的阀瓣节门，则气路系统的压力骤增，容易损坏色谱仪中的阀门。,3、气路检查,气相色谱仪的气路要认真仔细地进行检漏。气路不密封将会在检验过程中出现异常现象，造成数据不准确。用氢气作载气时，氢气若从柱接口漏进柱恒温箱，可能会发生爆炸事故。最常用的检漏方法是皂膜检漏法。,皂膜检
14、漏法：即用毛笔蘸上中性皂液涂在各接头处检漏，检毕用干布将皂液擦净。,封闭系统压力法检漏,对于安有转子流量计的仪器，用封闭系统压力法检漏则 更方便。将氮气通入气路系统，观察气流是否通畅，然后关闭出口处，当充人0.30.5MPa 的氮气后，转子流量计的转子若下降到底，则表明流量计以后的气路不漏气。这时再关闭气体入口处，待气压平稳 后读取柱前压力，0.5h后再次读取柱前压力，若下降值不超过0.01 MPa，则可认为整个气路不漏气。,（二）气相色谱仪的操作,气相色谱分析所采用的检测器不同，其操作程序有所不同，以具有氢火焰离子化检测器（FID)色谱仪为例，介绍气相色谱仪的操作。不同的生产厂商、不同型号的
15、气相色谱仪在操作步骤上也有差异，这里只作一般的介绍。,1、开机前的准备,（1）首先安装好色谱柱(不能接反)，并将色谱柱的末端经连接管接入氢火焰离子化室（又称离子头）进口部位。（2）检查仪器各部分连接是否正确，检查各稳压阀、针形阀及减压表旋杆是否在关断位置。（3）开启载气钢瓶、调节减压阀、稳压阀及针形阀，使柱前压和载气流速达到预定值。（4）进行检漏，当氮气、氢气、空气都试漏完毕，关闭氢气和空气。只留开氮气作载气。,2、开机和色谱条件的设置,（1）打开仪器电源开关，使仪器通电(注意:仪器未接通载气时，切不可通电，否则色谱柱和检测器均可能被烧坏)。(2)进行仪器的自检，仪器则自动判断整个仪器系统中所
16、有电子电路是否正常。（3）设置所需柱箱温度、进样口温度和检测器温度(FID检测器的温度应高于110，否则点火后会 造成 检测器内积水而影响基线的稳定性)，并开始升温。,3、点火和色谱测定,（1）打开空气、氢气阀门，分别调节两路气体流量(由流量计显示)为适当值。操作中气体流速一般控制的比例为:氮气:氢气:空气=(1：1l.5）:(1015）。,(2)待检测器温度达到了设定温度后，按动点火键，若听到 爆鸣声或用一光亮的冷金属片放在FID检测器排气口上方，有冷凝水生成，则证明火巳点着。有时可能会点不着火，可加大氢气流量。待点火后，再缓慢减小氢气流量至正常值。,(3)根据需要设置FID微电流放大器的灵
17、敏度，并设置输出信号衰减，调节“零点”电 位器，使FID输出信号在数据处理机或微机图谱的零位附近。,(4)点火后，待仪器稳定0.5h，基线平稳后，即可进行色谱测定。进样后，若出现反峰，将仪器信号线两个接头对调即可,4、色谱图的分析判断及色谱参数的调整,（1）正常出峰后，可对微机的显示屏或打出的色谱图进行观察分析 各组分是否都流出了(这对用归化法进行定量很重要)?各组分流出时间是否太长?各组分的峰分离情况如何?各组分的峰是否对称?峰的大小是否合适？由此判断 色谱条件和色谱处理参数设置是否合理。,(2)一般检验方法标准中都给出了色谱分析条件和色谱处理参数,这些均为典型的色谱条件和参数，可根据仪器的
18、性能和色谱 条件合适与否，主要看柱温和载气的流速。,5.定量分析操作,(1）当色谱条件和数据处理参数设置合理后，可进行标准样品的测定，并求出各组分的校正因子。(2)各组分的校正因子求出后，可进行未知样品的分析和测定。定量方法将在以后专门叙述。6.关机先将输人氢气和空气的阀门关闭，以切断FI的燃 然后降低温度。当柱箱温度低于80C以下时，才能关闭载气和电 442,6.关机,先将输入氢气和空气的阀门关闭，以切断FID的燃气和助燃气，使火焰熄灭，然后降低温度。当柱箱温度低于80以下时，才能关闭载气和电源开关。,二、高效液相色谱法（HPLC)（高速液相色谱法、高压液相色谱法）由经典的液相层析法发展来的
19、，始于1906年，比气相色谱分析法早四十多年。但一度停滞，因其流动相靠自身的重力流过色谱柱，效率低，分析周期长，缺乏自动灵敏的检测装置。70年代后，又吸取气相经验迅速发展。,高效液相色谱的特点：应用范围广 只要能制成 溶液的样品都能分析，不受试样挥发性的约束，对无法用气相分离的沸点高，热稳定性差，分子量大的聚合物及离子形物质，具有很大的适用性，都可用他来进行分离，分析。高压供液压力和进样压力均很高，一般1530 mpa最高 500 mpa。,高速 由于高压，流动相在色谱柱内流速一般为110ml分，个别达100 ml分以上。高效 柱效达 5000 塔板m，而分离效能很高 的GC柱效约 2000
20、塔板m。灵敏度高 采用了高灵敏度检测器，如紫外检测器 的最小检测量10-9gml,荧光检测器的 最小检测量10-11gml。,（二）高效液相色谱的类型流动相 液相固定相 固体吸附剂 液相+支持剂 离子交换树脂 凝胶按分离原理分：1.液固吸附色谱 2.液液分配色谱3.离子交换色谱 4.空间排阻色谱,（三）高效液相色谱仪的基本组成1.输液系统高压泵、贮液器、过滤器、梯度洗脱装置2.进样系统进样器3.分离系统色谱柱、恒温器4.检测系统检测器5.数据处理系统记录仪等,可见264页,三、离子交换色谱法（羧酸分析仪）,（一）原理：阴离子交换树脂柱分离，利用羧基显色。（二）适用范围：适用范围较广，但是不能检测草酸。（三）仪器：羧酸分析仪六、酮酸的薄层色谱法（自学）,荧光分析法与可见紫外及红外分光光度法同属于分子吸收光谱，用于测量微量及限量分析。原理：当用紫外线照射样品时，样品能发射出反映该物质特性的荧光光谱及荧光强度，由此来进行物质的定性和定量分析的方法为荧光分析法。极谱分析光学分析的一种。,
