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1、第五章 酶的分离纯化,Contents of chapter 5,细胞结构与酶分布,5.1 酶的提取、分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心，过滤，沉淀，层析，电泳，萃取，结晶等。,酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1)粗蛋白质(crude protein):采样 均质打破细胞 抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2)部分纯化(partially purified):使用各种柱层析法。均质酶(homogeneous):目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳或高效液相色谱。(3)浓缩与干燥（concentra
2、tion and desiccation）使酶与溶剂分离的过程，使用蒸发、冷冻干燥等方法。,酶分离纯化过程,本章目录,5.1.1酶分离纯化的基本原则,1.防止酶变性失效（1）一般在低温下进行（2）控制pH不要过酸、过碱（3）尽量减少泡沫（4）防止重金属、有机溶剂引起酶变性，防止微生物污染和蛋白酶水解。2.选择有效的纯化方式（1）在不破坏待纯化酶的限度内，使用各种“激烈”手段。（2）使用亲和剂进行纯化。3.酶活性测定贯穿纯化过程始终。,5.1.2酶的组合分离纯化策略,设计分离纯化工艺的基本要求,5.2 酶的提取（粗分离）,5.2.1 发酵液预处理5.2.2 细胞破碎5.2.3 酶的提取5.2.4
3、 离心分离5.2.5 沉淀分离5.2.6 萃取分离,5.2.1 发酵液预处理,1.发酵液相对纯化2.发酵液固液分离,1.发酵液相对纯化,（1）无机离子的去除（2）杂蛋白的去除（3）色素及其他物质的去除,（1）无机离子的去除,钙离子草酸 镁离子三聚磷酸钠 铁离子黄血盐,（2）杂蛋白的去除,1）沉淀法pH、盐析2）变性法加热、极端pH、有机溶剂3）凝聚和絮凝电解质、有机絮凝剂4）吸附法吸附剂,（3）色素及其他物质的去除,活性炭离子交换树脂、离子交换纤维大孔吸附树脂专用脱色树脂,2.发酵液固液分离,提高过滤性能的方法 絮凝和凝聚 稀释 助滤剂不可压缩的多孔微粒,过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形
4、状的物质分离的技术过程。,过滤,5.2.2 细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎,JY92-II D超声波细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,机械破碎,捣碎法研磨法匀浆法,物理破碎,温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法,化学破碎,有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween,酶促破碎,自溶法外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而
5、使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,本章目录,酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。,5.2.3 酶的提取,提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短
6、扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。,为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。,酶的主要提取方法,大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。,本章目录,5.2.4 沉淀分离,沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。,在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。,在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常
7、用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。,在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。,在一定的温度和pH值条件下（为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析；而在一定的盐和离子强度的条件下（KsI为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为分段盐析。,在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁
8、、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。,在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。,有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀
9、析出。,常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等,离心分离,离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。,常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。,高速离心机的最大转速为（12.5）104 r/min，相对离心力达到 11041105 g，在酶的分离中主要用于沉淀、
10、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。,超速离心机的最大转速达(2.512)104 r/min，相对离心力可以高达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。,超速离心机按照其用途可以分为制备用超速离心机、分析用超速离心机和分析-制备两用超速离心机3种,蛋白质分子在离心時，其 分子量、分子密度、组成、形状 等，均会影响其沉降速率，沉降係系数 即用來描述此沉降性质；其单位为 S(Svedberg un
11、it)。每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。,5.2.6 萃取分离,萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。,按照两相的组成不同，萃取可以分为：有机溶剂萃取双水相萃取超临界萃取反胶束萃取,5.3酶的精制（细分离）,5.3.1 膜分离5.3.2 层析分离5.3.3 电泳分离,借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合
12、物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。,5.3.1 膜分离,根据膜材料和不同进料液的特性，商品应用的膜产品通常采取如下几种结构形式：管式；中空纤维；卷式；平板式。,四种常用膜分离技术的基本特征（孔径）,四种常用膜分离过程的截留特性,层析分离,层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达
13、到分离。,吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。,分配层析,分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数。,在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。,纸上层析分配薄层层析分配气相层析,离子交换层析是利用
14、离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。,离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。,离子交换层析,凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。,凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，
15、大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。,凝胶层析,亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应
16、用.,亲和层析,5.3.2 电泳分离,带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。,电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为：纸电泳 薄层电泳 薄膜电泳 凝胶电泳 自由电泳 等电聚焦电泳,颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。,制备式电泳通常以不含 SDS 的原态 disc-PAGE 进行，以便回收具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。,5.5 酶的浓缩、干燥,浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）
17、分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。,离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60以下进行浓缩。,在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥冷冻干燥喷雾干燥气流干燥吸附干燥,结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。,酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度。通常酶的纯度应当在50%以上。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。不同的酶对结晶时的纯度要求不同。有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。,蒸发结晶降温结晶盐析结晶有机溶剂结晶等电点结晶,结晶,
