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1、第二章 克隆技术,第二节 植物的克隆,植物克隆的技术基础：植物组织培养,植物细胞全能性：植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性，因而具有发育成完整植株的潜能。,细胞全能性的比较：,受精卵生殖细胞体细胞植物细胞动物细胞分化程度低的细胞分化程度高的细胞,为什么植物细胞具有全能性？,细胞具有发育成完整个体所需要的全套基因,植物组织培养的理论基础（原理）：细胞的全能性,以下不能说明细胞全能性的实验是:A、胡萝卜韧皮部细胞培育出植株B、紫色糯性玉米种子培育出植株C、转入抗虫基因的棉花细胞培育出植株D、番茄与马铃薯体细胞杂交后培育出的植株,在生物体内，细胞没有表现出全能性，而是分化为不同的组织、器官，是
2、因为：,A、细胞丧失了全能性,B、基因的表达有选择性,C、不同的细胞内基因不完全相同,B,细胞离体、一定的营养物质、生长调节剂、无菌等其他外界条件,必要条件：,、配置半固体培养基、获取植物组织、获得愈伤组织、培育新植株,植物组织培养程序,成分？,植物组织培养的一般程序：,脱分化,愈伤组织：相对没有分化的活的薄壁细胞团组成的新生组织,再分化,调节营养物质和生长调节剂的适当配比（P24）,诱导根、芽顶端分生组织,离体的植物器官、组织或细胞,愈伤组织,根、芽,小植株,外植体,脱分化,植物激素：细胞分裂素、生长素等,再分化,植物组织培养,植物组织培养条件：,一定的营养物质和植物生长调节剂、一定的温度、
3、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。,获得产物,如：紫草素,植物组织培养的一般程序：,脱分化,通过悬浮培养分散成单细胞,细胞质丰富、液泡小而细胞核大（胚性细胞的特征）,再分化,调节营养物质和生长调节剂的适当配比（P24）,包裹人工种皮，形成人工种子,胚状体,人工种皮相当于什么？,离体的植物器官、组织或细胞,愈伤组织,胚状体,小植株,外植体,脱分化,植物激素：细胞分裂素、生长素等,再分化,植物组织培养,单细胞,通过悬浮培养分散成,包以人工种皮，形成人工种子,下列有关植物组织培养过程中细胞脱分化的说法，不正确的是A、已经分化的细胞失去特有的结构和功能而转变成未分化的细胞的过程B、已经分化的细胞
4、转变为具有分生能力的薄壁细胞，进而形成植物愈伤组织的过程C、离体的植物组织在一定的条件下分化出根和芽的过程D、离体的植物组织在脱分化形成愈伤组织的过程中必须经过有关激素的诱导,植物组织培养形成的愈伤组织进行培养，又可以分化形成根、芽等器官，这一过程称为：,下列不能作为植物组织培养的材料是：,C,D,植物组培小诗,植物细胞本领强离体状态能生长无菌人工控制下培养基上显风光器官组织和细胞脱分化后成愈伤再分化后芽根壮养成完整植株体多亏全能性来帮忙,植物组织培养,有性生殖,克隆,植物细胞全能性的体现：几乎所有植物细胞都可,注：细胞全能性表达程度受植物种类和基 因型的影响,植物克隆成功的条件：1、深入探讨
5、特定植物细胞全能性的表达条件2、尽量选择性状优良、细胞全能性表达充分的 基因型,细胞培养和器官培养：,愈伤组织细胞芽和根的分生组织完整植株,愈伤组织细胞单细胞细胞团球形胚心形胚胚状体完整植株,愈伤组织器官,器官发生和形态建成主要是通过平衡的植物激素配比进行调控。,植物细胞培养和器官培养的主要意义：（P25）,激素调控：生长素含量高于细胞分裂素时，主要诱导植物组织脱分化和根原基的形成；当细胞分裂素的效应高于生长素时，主要诱导植物组织再分化和芽原基的形成。,、可以在实验室环境进行植物受精过程和植物胚胎发育过程，以及调节控制这些过程的环境因素、遗传基础和分子及生理生化机理研究；、可以进行遗传工程的操
6、作，完成与植物生长发育有关的重要基因或影响因素的研究；、可以通过实验手段培育植物新品种。,植物细胞培养和器官培养的意义,原生质体培养与植物细胞工程,2、获得原生质体 的方法：纤维素酶和果胶酶溶液处理,3、原理：细胞壁主要成分纤维素和果胶,1、原生质体：细胞中有代谢活性的部分，包括质膜、细胞质、细胞核,3、植物细胞工程：,植物细胞个体,植物细胞原生质体个体,转基因细胞个体,重组细胞个体,花粉细胞单倍体个体,植物细胞杂交,酶解法（纤维素酶、果胶酶）,意义：克服远缘杂交不亲和的障碍，培育出作物新品种。,杂种细胞形成的标志,杂种细胞的类型？,植物组织培养,杂种植株是几倍体？,融合方法？,多途径的植物克
7、隆实践：P25,植物克隆的发展：1、探索阶段2、奠基阶段3、成熟发展阶段,第二章 克隆技术,第三节 动物的克隆,动物细胞与组织培养,细胞克隆,单克隆抗体,细胞核移植,动物的克隆常用技术,动物细胞融合,动物细胞与组织培养是动物克隆的技术基础,动物克隆的技术基础：动物细胞和组织培养,细胞生物学的主要技术基础：细胞培养,动物细胞培养的原理：细胞增殖,细胞工程（细胞生物学）的主要技术手段：细胞培养和细胞融合,细胞工程：细胞水平上的生物工程（P31）,动物细胞的培养和克隆的形成,当一个人烧伤需要皮肤移植的时候,最好移植谁的?,1、自己2、同卵双胞胎兄弟或姐妹3、父母4、一般兄弟或姐妹5、其他人,动物细胞
8、培养过程：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,机械消化胰蛋白酶消化,10代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,（分解弹性纤维）,分装成多个培养瓶,接触抑制,成分？,为什么？,原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,动物组织培养技术的发展,细胞系和细胞株,细胞系：可连续传代是细胞,细胞系种类：,1、连续细胞系：原代培养物在首次传代时就成为细胞系，能连续培养下去的细胞系,2、有限细胞系：原代培养物在
9、首次传代时就成为细胞系，不能连续培养下去的细胞系,原因：发生转化，大多数具有异倍体核型如：恶性细胞系（具有异体致瘤性）获得不死性（保留接触抑制，不致癌）,细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞,细胞株的特点：具有恒定的染色体组型、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等,细胞株的种类：,1、连续细胞株：可连续多次传代,2、有限细胞株：可连续次数有限,细胞系和细胞株,细胞系泛指可传代的细胞，细胞株是具有特殊性质的细胞系,动物组织培养：（P28）动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性。,动物细胞培养和动物组织培养：可以统称为组织培养,获得细胞,细胞的全
10、能性,细胞株、细胞系,植物体,培养结果,或细胞分泌蛋白,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物组织培养和动物细胞培养的比较,具 体应用,得到,动 物 组 织 培 养,胚胎或幼龄动物的脏器,单 个 细 胞,原 代 培养,传代培养,大量的组织细胞(构成组织或器官),修复受损皮肤、器官等,细胞株或细胞系,动 物 组 织 培 养,胚胎或幼龄动物的脏器,单 个 细 胞,原 代 培养,传代培养,药物,研究治疗癌症的药物及其疗效,某物质,检测有毒物质、致癌物质等,细
11、胞株或细胞系,2005年4月,美国一家非官方癌症研究中心发布信息说,“高露洁”牙膏中含有的抗菌化学物质三氯生可能是致癌物质。公众对此表示怀疑。科研人员欲采用一定的技术手段探究三氯生对人体是否有危害。请回答：1、根据所学的动物细胞工程知识，采取下列哪种技术手段最合适A、动物细胞融合B、动物细胞培养C、胚胎移植D、核移植,2、根据上述选择，请你设计一个实验来探究“三氯生”对人体是否有危害。（1）该实验的原理是,B,许多致畸物质加入动物细胞培养液后，培养细胞会发生染色体结构或数目的变异。根据变异细胞占观察培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性,（2）实验方法步骤：材料准备：从医院妇产科获得所需要的
12、原始材料组织，浓度为0.09%的三氯生试剂,高倍显微镜,培养瓶若干,配置好的培养液,剪刀,培养箱,所需要的酶.制备检测细胞配置细胞悬浮液:（）将细胞悬浮液分装到两个以上的培养瓶中,置于培养箱中培养一段时间.配置培养液:取两个培养瓶,分别编号1、2，（）,将上述组织用剪刀剪碎，再用胰蛋白酶使其分散成单个细胞，然后利用培养液配置成一定浓度的细胞悬浮液,分别往其中加入等量的配置好的培养液，再往1号瓶中滴加几滴0.09%的“三氯生”试剂，摇匀,将上述某一个培养状况较好的培养瓶中的细胞培养液分成两份，分别加入1、2号培养瓶中，培养一段时间。检测过程：分别从1、2号培养瓶中取样做多次镜检，计算出变异细胞占
13、观察培养细胞的百分数。预期结果和结论：a:若1号和2号培养瓶中变异细胞的百分比相当，则说明“三氯生”对人体无害。b:若1号培养瓶中变异细胞百分数大于2号，则说明“三氯生”对人体有害。,克隆培养法（细胞克隆）,把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个细胞群体的技术。,细胞克隆的最基本要求：克隆来源于单个细胞,细胞克隆较易成功的细胞：无限细胞系、转化细胞系、肿瘤细胞,提高细胞克隆形成率的措施：P30选择适宜的培养基、添加血清、以滋养细胞支持生长、激素刺激、使用CO2培养箱调节pH,细胞克隆的最主要用途之一：分离缺乏特殊基因的突变细胞系,动物的细胞融合技术及其应用,细胞融合是将不同种类的
14、两种细胞经过特殊处理后放在一起，在某些促融因子作用下发生融合，形成杂种细胞。,细胞A,细胞B,融合细胞,电融合,动物的细胞融合技术及其应用,基因型不同的细胞融合就是细胞杂交,基因定位,一、动物细胞融合的原理：,与植物细胞原生质体融合的基本原理相同,利用:细胞膜的流动性,植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,单克隆抗体,传统方法获取抗体，产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。,1、起因：抗体的作用很大,传统获取抗体的方法：,某种抗原注射到动物体内（需要反复注射）,动物体内产生抗体,从动物的 血清中分离出所需要的抗体,科学家分析、探索过程：,1、体内B淋巴细胞可以产生多达百万种以上的特异
15、性抗体；,2、每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体,3、临床医学目的：获得大量的单一抗体,理论方法：用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，也就是通过克隆，形成细胞群，由该细胞群就能产生出单克隆抗体（化学性质单一、特异性强的抗体）,4、遇到的难题：体外培养时，一个B淋巴细胞不可能无限繁殖，无法得到大细胞群,大胆设想：小鼠骨髓瘤细胞：能在体外培养下大量增殖,小鼠骨髓瘤细胞+某一种淋巴细胞,某一种淋巴细胞：能产生特异性抗体,过程：,抗原,注 射入小鼠 体内,B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,细胞融合 筛选,杂交瘤细胞,细胞 培养,选出能产 生特定抗体的细胞 群，继续培养,A细胞,B细胞,（B淋巴细胞）,（骨髓瘤细胞）,
16、问：这2种细胞经过融合过程可产生多少种细胞？,淋巴细胞：S，D途径合成DNA，但一般不分裂骨髓瘤细胞：D途径合成DNA，能不断分裂注：D途径可被氨基嘌呤阻断,筛选杂交瘤细胞：加氨基嘌呤，收集连续分裂的细胞,选择培养基,B淋巴细胞,一般不分裂,骨髓瘤细胞,能不断分裂,合成DNA分子的途径,特点,S途径,D途径,D途径可被氨基嘌呤阻断（添加氨基嘌呤后）,D途径,能不断分裂,S途径,D途径,死亡,存活,存活,继续培养,死亡,存活,筛选出的细胞,杂交瘤细胞,返回,乙肝病毒,B淋巴细胞,浆细胞,抗 体,Y,抗原1,抗原2,抗原3,Y,Y,抗乙肝抗体,抗 体2,抗 体3,B淋巴细胞1,B淋巴细胞2,B淋巴
17、细胞3,骨髓瘤细胞,杂交瘤细胞1,杂交瘤细胞2,杂交瘤细胞3,抗体1,抗体2,抗体3,Y,Y,Y,选出符合要求的杂交瘤细胞(能产生特定抗体),Y,Y,能发生特异性结合,不能发生特异性结合,抗原1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,Y1,克隆,杂交瘤细胞增殖产生的 细胞群,杂交瘤细胞,增殖,产生,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,抗体,单克隆抗体,称做,概念:单个杂交瘤细胞增殖形成的细胞群所产生的抗体.,返回,体外培养,体内培养,从培养瓶中提取,注射入小鼠的腹腔中,从小鼠的腹
18、水中提取,放入培养瓶中培养,单克隆抗体,动物细胞培养,杂交瘤细胞,用抗原免疫小鼠,免疫B细胞,骨髓瘤细胞,在PEG作用下融合成杂交瘤细胞,HAT培养基筛选,杂交瘤细胞增殖,未增殖细胞死亡,筛选产生特异性抗体的杂交瘤细胞,克隆化,制备单克隆抗体,单克隆抗体的应用：,*疾病的诊断、治疗和预防,优点：特异性强，灵敏度高，优越性强,临床应用：1.单抗探针2.生物导弹 单克隆抗体具有高度专一性，能够识别细胞表面抗原、各种受体、各种体液成分及细胞内和组织内的各种成分，能精确地瞄准和捕获靶细胞，特异性地与靶目标发生反应，因而有“生物导弹”之称。,正在研究：用单克隆抗体治疗癌症,动物的克隆繁殖,动物体细胞难以
19、克隆的原因？,动物体细胞高度分化,动物细胞全能性的表现程度,囊胚,桑椹胚,组织、器官分化、形成个体,受精卵,四分裂球,八分裂球,原肠胚,仍具有全能性,多能干细胞：具有分化出多种组织细胞的潜能,单能造血干细胞,动物的克隆繁殖,动物细胞的全能性,全能性大小比较：受精卵胚胎干细胞 组织干细胞生殖细胞高度分化的体细胞,去核的卵细胞,乳腺细胞核,重组细胞,细胞核移植实验和动物的克隆繁殖,核移植：利用一个细胞的细胞核（供体核）来取代另一细胞中的细胞核，形成一个“合子”,两栖类细胞核移植,1981年，瑞士日内瓦大学和美国杰克逊实验室合作，首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。,277次乳腺细胞核移植实验；获得2
20、9个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。,分裂3次,细胞质,细胞核,细胞核移植,多莉羊的培育过程,为什么选择卵细胞？,多莉羊的克隆成功证明：,1、高度分化细胞经一定技术处理，也可回复到类似受精卵时期的功能。,2、在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核（包括异源的细胞核）发育的作用。,胚胎克隆 使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段的胚胎，叫做胚胎克隆。体细胞克隆 使用的核供体细胞来自动物体细胞，叫做 体细胞克隆。,克隆技术的应用：P37,1、遗传疾病的治疗,2、培育优良品种,3、濒危动物的保存,4、转基因动物的扩群,5、生产克隆产品，如药物等,下图表示利用植物细胞工程对棉花进行改良的过程，据图分析错误的是A过程需在适宜条件下用纤维酶和果胶酶处理B过程定向改变原生质体的遗传特性C过程需要通过液体悬浮培养D过程需用适宜浓度的生长调节剂处理,C,下列有关克隆的叙述错误的是A二倍体细胞的传代培养次数通常是有限的B克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变C每个细胞中都携带整套遗传信息是植物克隆的物质基础D单倍体克隆过程能够发生基因突变,B,
