蛋白质定量ppt课件.ppt

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1、第三章 蛋白质的定性定量分析,第一节 蛋白质的含量测定 第二节 其它蛋白质定性定量分析技术 第三节 特定蛋白质含量的测定方法 第四节 蛋白质的分子量测定 第五节 等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点,意义: 蛋白质的定性定量分析技术是蛋白质结构与功能研究的重要基础工具。目的: 蛋白质定性分析 ( qualitative analysis ）的目的是确定在样品中是否存在蛋白质，存在的是什么蛋白分子。 蛋白质定量分析（quantitative analysis）的目的是确定样品中总蛋白（ total protein ）的含量或者某种单一蛋白成分的含量。,第一节 蛋白质的含量测定 目前蛋白质的直接定量分析

2、技术只能测定样品中的总蛋白含量。到目前为止，尚没有任何一种方法能够直接分析蛋白样品中某种专一蛋白成分的含量，除非将其高度纯化或采用间接方法测定。主要的蛋白质定量方法可以归纳为三类： 1.基于蛋白质的元素组成特点直接进行分析如凯氏定氮法； 2.在发现蛋白质的各种化学呈色反应基础上建立的各种比色法，如双缩眼法、 Folin 酚法、Lowry法、考马斯亮蓝染色法和 BCA （二喹啉甲酸）法等等； 3.基于蛋白质的光吸收特性的紫外光谱法。,一、凯氏定氮法： 该法是 1883 年丹麦化学家 Kjeldahl 建立的，后人在所用器材、定氮方法等方面均做过多次改良，使之在精确性、敏感性和操作的简便程度上不断

3、改进，至今它仍然是蛋白质定量的最为精确和标准的方法。（一）原理： 凯氏法是基于蛋白质的含氮量通常在16%左右这一特点的基础上而建立的，因此也称为凯氏定氮法（Kjeldahl determination）。,用凯氏蒸馏装置将氨收集到无几酸中，用标准碱溶液进行滴定确定氨量，根据氨量计算出样品的含氮量，进而计算出蛋白质的含量。,（二）凯氏法的基本流程 消化蒸馏滴定,消化装置,蒸馏装置,（三）凯氏定氮法的优缺点1.优点：适用于一切形态的样品，无论是固体还是液体都可以获得精确的分析结果。尤其是当样品溶液浑浊时，用其他方法不能进行蛋白质含量分析。而采用凯氏定氮法仍能可以获得可靠的结果。2.缺点：样品中存在

4、非蛋白氮对测定值有直接影响，测定前需除去；在构成蛋白质的氨基酸有偏差时，造成测定误差；操作过程繁琐，对操作者的技术熟练程度要求高。,（四）凯氏定氮法用途 测定范围在0.3-3g蛋白质，由于凯氏定氮法是蛋白质的直接定量法，因此一直作为蛋白质的标准方法。凯氏定氮法在固体样品蛋白质分析中的应用仍然是其他方法所不能取代的，目前在农业及食品工业中，仍然作为动植物和食品蛋白质的含量测定法使用。,二、双缩脲法测定蛋白质含量 （1）原理： 在碱性溶液中，双缩脲（H2N-CO-NH-CO-NH2）与二价铜离子作用，生成紫红色的络合物，这个反应称为双缩脲反应。凡是分子中含有两个及两个以上酰胺基团（-CO-NH2）

5、或类似基团的任何化合物，均可发生双缩脲反应。蛋白质分子含有众多肽键（ -CO-NH-），故可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定范围内与肽键的数量即蛋白质含量成正比。,max540nm,三、Lowry法 是O.Lowry 在1951年发表J.chem的一个在Folin 酚试剂法和双缩脲法的基础上建立的蛋白质含量分析法，因此也称.Lowry改良法。（一）原理：涉及两步反应 第一步：基于双缩脲测定法，即在碱性溶液中含有肽键的化合物可以与Cu+反应形成紫红色的络合物，其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。 第二步：基于Folin酚试剂（磷钼酸和磷钨酸混合液）法中酚试剂与蛋白质中的芳香族氨基酸（色氨酸和酪氨酸

6、）反应呈现深兰色的原理。 深蓝色的鉬蓝和钨蓝混合物测得A500值,Folin酚试剂：甲试剂：碳酸钠 氢氧化钠 硫酸铜 酒石酸钾纳 （NaKC4H4O64H2O ）乙试剂：磷钼酸 磷钨酸 硫酸 溴,（二）Lowry法优缺点 1.优点： （1）具有与比色法的共同优点，即可对多个样品同时 进行分析 （2）灵敏度提高（比双缩脲法灵敏100倍），比紫外灵 敏10-20倍，与凯氏法相当，操作简便。 （3）结合双缩脲反应避免了酚试剂反应局限于色氨酸 和酪氨酸所造成的蛋白质含量测定偏差。 2.缺点 （1）比色法要求保持光学透明度，因而对样品的溶解 度要求高。 （2）酚试剂在碱性溶液中的稳定性差易，导致误差。

7、（3）反应易受多种物质干扰，如巯基化合物、糖类、 钾离子、甘油、尿素、游离氨基酸和核酸类物质 均干扰测定结果。,（三） Lowry法用途 测定范围为：115 g/mL。 Lowry法目前仍是较常用的蛋白质定量分析方法，例如，我国在生物制品检查中规定，应采用Lowry法确定产品的蛋白质的含量。,四、紫外光吸收法（一）原理： 蛋白质在紫外区有两个吸收峰。一个吸收峰在 280nm 处，是由蛋白质中的芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的苯环上的共扼双键引起的。其中色氨酸的光吸收最强酪氨酸次之苯丙氨酸较弱。大部分蛋白质中的芳香族氨基酸含量差别不是很大，故可以用溶液在 280nm处的吸光度推算出蛋白含量

8、。 相对纯化的、无核酸污染的蛋白质的紫外吸收比值（A280/A260）约为1.8，如此值过低，表明有较多的的核酸杂质存在。 蛋白质在紫外区的另一个吸收峰是由肽键造成的。蛋白质溶液在 240nm 以下时光密度急剧增加，215nm 处的吸收率为 280nm 处的数倍。对含量很低的蛋白溶液可以用 215nm 处的光密度和 225nm 处的光密度之差来测定蛋白含量。,蛋白质紫外吸收定量计算,光吸收值 A 的Beer-Lambert公式: A = kcl = log (Io/I) = -log T, T (透过率,%) = I / Io ; k, 消光系数; c, 摩尔浓度; l, 样品池长度; I,

9、光强度 对混合蛋白质样品: 1 OD280nm 1 mg/ml 对特定蛋白质的光吸收值的理论值: A280(1 mg/mL) = (5690Nw + 1280Ny + 120 Nc)/M Nw,Ny和Nc分别为Trp,Tyr和Cys的数量, M为分子量;Scopes的经验公式: A2051 mg/ml = 27 + 120 (A280/A205)蛋白质也可以下列经验公式定量: Protein concentration(ug/ml) = 144 (A215 -A225)有核酸混入时, 有三种近似计算法: Protein concentration (mg/ml) = 1.55A280 - 0.

10、76A260 Protein concentration (mg/ml) = (A235 -A280)/2.51 Protein concentration (mg/ml) = 0.813A230 - 0.0758A260,（二）紫外光谱吸收法的优缺点 1.优点： （1）紫外光谱吸收法最大的优点是简便，样品经稀释后，只 需倒人比色杯测定光密度即可其次是敏感度高。 （2）另外一个特殊的优点是样品不损失，测定后可以继续使 用。 2.缺点： 精确度差，其原因包括： 在同一紫外区有较强吸收的物质（核酸或某些缓冲液成 分）强烈干扰测定结果； 不同蛋白质中芳香族氨基酸含量变动过大时，也会使在 用280nm

11、测定时结果出现较大偏差； 用215 225nm波长测定时散射光线干扰大难以准确 定量； 要求完全透明的蛋白质溶液。,（三）紫外光谱吸收法的用途 1.快速含量检测：紫外光谱吸收法主要用于蛋白质的快速含量 检测，此时对蛋白质的定性需求高于准确定量需求。2.纯化过程中监测蛋白：最常用的是在蛋白质纯化过程中，尤 其是各种色谱纯化过程中监测蛋白质的位置，判断吸附和洗 脱情况。3.另外，对于一些准确度要求不高的蛋白质定量的实验，也可 以用紫外光谱吸收法估测溶液中的蛋白质含量。用 215 / 225nm 波长测定的敏感度很高，所以在一些过于稀释的微量蛋白纯化过程中是一个十分有用的工具。,（四）紫外光谱吸收法

12、的操作 取一定体积适当稀释的蛋白质溶液，放人石英比色杯内，在紫外分光光度计上读取相应波长处的光密度。光密度读数应该在 0.1 到 0.8 之间，低于或高于此范围都会产生较大的误差。 1.做出标准曲线：用光密度读数计算溶液中蛋白质含量的方法有两种。一种是像一般比色法一样，同时读取一系列倍比稀释的已知蛋白含量的标准品溶液的紫外吸收光密度值，做出标准曲线，将样品与标准曲线相比即可计算出其蛋白质含量。 2.不做标准曲线：直接根据溶液的A280/A260比值，用以下经验公式估算出蛋白质含量： 蛋白质浓度(mg/ml)= 1 . 45x A280 0.74x/A260,（五）紫外光谱吸收法的注意事项 1.

13、用于仪器调零的液体要与待测样品一致， 2.标准蛋白也需要使用同样的溶剂，以避免溶剂 的紫外吸收特性干扰样品的测定,五、考马斯亮蓝染色法 考马斯亮蓝染色法是 1976 年由 Bradfo 等人建立的，因此也称为 Bradford 法。该法近年来在某些方面有取代经典的Lowry趋势，这是因为它操作简单、反应时间短。（一）原理 考马斯亮蓝G-250在一定浓度的乙醇和酸性溶液中，呈现红色。在此溶液下，考马斯亮蓝G-250可以与蛋白质结合，并导致考马斯亮蓝G-250的颜色从红色变为兰色，最大吸收峰从465nm移至595nm。考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的复合物在595nm波长处具有很高的光吸收，并与

14、溶液中的蛋白质浓度呈正比。,考马斯亮蓝G-250的结构：,（二）考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过02影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。1Bradford浓染液的配制：将100rug考马斯亮蓝G-250溶于50m1 95乙醇，加入100ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放413至少6个月保持稳定。 2标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为

15、标准蛋白。通常在20ug150ug100ul之间绘制标准曲线。,3将待测样本溶于1001缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。4按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。5每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用530rain。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min6根据标准曲线计算待测样本的浓度。 手上沾到了考马斯亮蓝？考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。,（三）考马斯亮蓝染色法的优缺点1.优

16、点：操作简便；灵敏度高与Lowry法4倍； 测定范围：10-100g。 考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合快，2min即可 反应完全，生成的复合物颜色稳定1小时； 对干扰剂不像Lowry法及紫外吸收法那样敏感。2.缺点：因染料与蛋白质的实际反应状况很复杂，色素 与样的蛋白质不一定以化学当量相结合，有时 会有非特异吸附的情况； 要求样品完全溶解； 样品不能回收使用。,六、 BCA (bicinchoninic acid)法 FDA唯一认可 BCA：二喹啉甲酸该检测法采用的是一种改进的Lowry法。 第一步反应仍然是在碱性溶液中蛋白质与Cu2+反应形成络 合物。 第二步是 BCA 试剂与该络合物在5

17、62nm处的颜色反应。 优点：操作简单，产物稳定，检测敏感性高。操作方法与上述的比色法类似都需要在测定的同时制作标准曲线。 缺点：仍然会受到一些物质，如含琉基试剂和去垢剂的干扰。,表 2 1 汇总了几种蛋白质含量测定方法的部分特征数据，可根据样品的具体情况选用：,第二节 其他蛋白质定性定量分析技术 我们介绍了样品中蛋白质的定量方法。虽然目前尚缺乏直接分析混合蛋白质样品中某种专一蛋白质的方法，但是已经有一些方法可以间接地对样品中蛋白质的种类、含量及翻译后修饰特性进行分析。如蛋白电泳染色分析、免疫印迹分析技术及放射免疫分析技术等等。,一、蛋白质的电泳染色定量 不同蛋白质的混合液在进行一般定量分析时

18、，是无法对其中的某一种蛋白质进行单独定量的。如果先用电泳技术将混合液中不同的蛋白质分离开，则可以通过蛋白质的染色知道某种蛋白质的相对含量。 这里的含量分析有两个含义，一是得到某种蛋白质在总蛋白中所占的比例；二是与标准蛋白比较得知某种蛋白质的含量。 多种染色方法可以用于电泳后蛋白质的定性定量分析。这些染色方法包括考马斯亮蓝 R-250 染色法、银染色法（ silver staining ）、氨基黑 l0B 染色法和丽春红 S ( Ponceau S ）染色法等，其中前两种方法主要用在电泳胶的染色，而后几种方法主要用于固定于硝基膜或其它蛋白转移膜上的蛋白质的染色。,（一）特定蛋白质在总蛋白中所占比

19、例的分析 将血浆蛋白电泳分离后染色计算其中白蛋白和球蛋白的比例是此法的最早应用。 当用原核细胞或真核细胞表达外源基因时，我们都希望表达的目的蛋白在总蛋白中占有较高的比例，从而有利于后续的纯化工作。这一资料可以通过蛋白质分离后染色而获得。这里以用大肠杆菌表达肿瘤坏死因子 TNF 为例说明其基本操作。,取 100l诱导表达后的细菌培养液，离心去上清，用 PBS 洗涤一次，在菌体沉淀中加入SDS-PAGE 上样缓冲液 50l ，震荡使菌体完全悬浮， 95 加热 3min ，离心，将 25 l上清加到准备好的 SDS -PAGE 胶的样品槽中，电泳后用 0.25 考马斯亮蓝 R-250 染色液染色后脱

20、色，最后在薄层扫描仪上扫描并计算出目的蛋白在总蛋白中所占的百分比（图 2 一 4 ）。,图 2 一 4 新型重组人肿瘤坏死因子在大肠杆菌中的表达效率分析A.表达产物的 SDS - PAGE 分析 。M ：分子量标准蛋白 1 ：未诱导 2 、 3 ： 诱导 B. A图中2泳道薄层扫描图C. B图峰面积计算值，第 11 峰为 TNF表达峰,有多种方法可以进行蛋白质的染色，其中考马斯亮蓝 R-250 染色法从敏感度和操作繁简的综合角度来讲是最为适宜的。如果蛋白含量过低，也可以用银染色法，不过操作相当繁琐。那些只有靠银染色才能检测到的外源表达蛋白也没有什么实用价值。,（二）特定蛋白质的含量分析 从蛋白

21、质电泳分离后的染色也可以获得某些蛋白质的定量资料。在进行待测样品电泳分析的同时在同一胶板上加上已知含量的标准蛋白（如牛血清白蛋白），电泳后用考马斯亮蓝R-250染色比较待测蛋白区带和标准蛋白区带的染色程度，可以估算出待测蛋白的含量。这一方法尤其适用于对一个实验中几种要同时使用并互为对照的蛋白质间浓度差的校正。,二、免疫印迹法分析特定蛋白质的相对含量（Western blotting） 是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的定性方法，也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同一细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。 印迹技术最初是用于核酸的分子检测，后来人们发现，蛋白质在电泳分离之后也可以转移并

22、固定与膜上，相对应于 DNA的Southern blotting 和RNA的Northern blotting ,该印迹方法亦被称为Western blotting。由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为免疫印迹技术（immunoblotting ）。,（一）基本原理 首先将蛋白质用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开，再将蛋白质通过电转移到NC膜或其他膜上，膜上蛋白质的位置可以保持在与胶相对的原位上。抗体作为蛋白质的检测探针。SDS-PAGE 电转移到膜（NC ）上 加非特异性蛋白封闭 洗膜 加一抗 洗膜 加标记生物素或辣根氧化酶的二抗 洗膜 加底物显色计算分子量或扫描定量。,SDS-PAG

23、E及Western blot鉴定重组蛋白 原理；1.按分子量大小分辨蛋白质 2.免疫印迹分析步骤：SDS-PAGE（M、整体菌体蛋白） 考马斯亮蓝G-250染色、脱色 分析电泳结果计算分子量,加3M滤纸及NC膜 电转移250mA,0.5-2.0h加10%小牛血清蛋白（BSA）的PBST 封闭30min加一抗（兔抗-非特异多抗）4 过夜PBST洗膜10min3次（洗去未结合的一抗）,第二次封闭（同第一次） 加二标记的抗（羊抗兔IgG1:2000）1h Tris-HCl洗膜10min3 次 DAB（3，3-二甲基联苯胺）显色,免疫印迹,1-3道是SDS胶：纯化的蛋白激酶样品被分离且用考马斯亮蓝染色

24、。4-6道是相同的样品，在SDS胶上分离之后，通过电泳被转移到硝酸纤维素膜上 。然后以抗蛋白激酶的抗体为探针进行杂交。,免疫印迹分析：,（四）酶联免疫吸附测定ELISA1.原理：同western blot.只是被侧蛋白被吸附在塑料制96孔板上，而不是通过电转衣到膜上。,抗体技术常规方法图解,1.用样品（抗原）包被表面,2.用非特异性蛋白封闭未结合样品的位置,3.加入抗特异性抗原的一抗进行温育,4.加入抗体-酶复合物进行温育，该复合物与一抗结合,5.添加底物,6.有色产物的生成表明特异性抗原的存在,2.方法,ELISA试验,检测血液中单疱疹病毒（HSV）抗体存在的ELISA。孔壁用HSV抗原覆盖

25、，这些抗原将与病人血液中抗HSV的抗体结合。二抗为抗人的IgG连接有辣根过氧化酶，含有更多HSV抗体的血液黄色更亮。,酶联免疫吸附测定：,3.酶联免疫吸附测定用途： 能快速筛查和定量一个抗原在样品中的存在。由于操作简便、易于重复和灵敏度高，已被广泛应用于生物学和临床诊断的常规检测。,免疫印迹,酶联,第三节 蛋白质相对分子量的测定 分子量（molecular weight MW ）是蛋白质的一个重要参数，研究细胞中各种蛋白质的结构与功能常常不能离开分子量的确定。 蛋白质精确的分子量是分子中含有的全部原子量的总和可以用质谱法测定，但是一般实验室难以完成。实际上，可以依据蛋白质的某些理化性质，如离心

26、沉降、排阻层析、粘度以及在电场中的移动等性质测定其分子量。这样获得的分子量是蛋白质的相对分子量（ relative molecular weight , Mr）。,分子量测定 方法 . 渗透压（osmotic pressure） . 沉降平衡（sedimentation equilibrium） . 凝胶过滤层析（gelfitratiochromatography） . SDS-PAGE . 激光解吸电离飞行时间质谱（LDI-TOF-MS）,一、渗透压（osmotic pressure） 公式：/ c = RT / M + K c ：渗透压 c：溶质浓度 R ：气体常数 T：绝对温度 M ：分

27、子量 同时测定几个不同浓度的渗透压，以/ c 对c 作图并 外推到蛋白质浓度为零，得截距，从而求出M。 为避免pH 值的影响，在溶解度允许的范围内，尽量采 用等电点或接近等电点的缓冲液，并增高溶液中无机盐 的浓度。 可以测分子量在110万范围的蛋白质。 实验装置简单，准确度高。但不能区别溶液中蛋白质分 子是否均一。,/ c,c,二、 沉降平衡（sedimentation equilibrium） x：蛋白质界面到旋转中心的距离 c：x 处的蛋白质浓度 ；溶剂的密度 ：角速度 v：蛋白质的偏微比容 （partial specific volume） 用较低的速度离心（8,00020,000 r/

28、min） 离心开始后，颗粒发生沉降，造成浓度梯度，同时产生 扩散作用。扩散力与离心力作用方向相反，相互平衡。,三、 SDS -PAGE 法测定蛋白质的相对分子量 前面详细介绍了聚丙烯酞胺凝胶电泳分离蛋白质的原理和方法。这里将介绍该方法在蛋白质相对分子量测定中的具体应用。（一）基本原理 蛋白质在电场中支持物上的迁移率差异主要依赖于样品中各种分子携带的电荷、分子的大小与形状的差别。要利用聚丙烯酞胺凝胶电泳测定某一物质的分子量，必须排除电荷、分子形状等因素（或使其作用减少到忽略不计的程度），使该物质迁移率（泳动率）的大小仅仅取决于其分子量的大小。 SDS-PAGE能分离差异小于 10% 的蛋白质。,

29、1967 年，Shapiro 等人发现，如果在聚丙烯酞胺凝胶电泳系统中加入阴离子去垢剂SDS后（SDS -PAGE ) ，蛋白质的迁移率将主要取决于其分子量的大小。 SDS 的作用是破坏蛋白质中的氢键和疏水键，并按一定的比例（ SDS 浓度大于 1mmol / L 时，每克蛋白质约结合 1.4gSDS ）和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷量，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。同时在系统中加入琉基乙醇破坏蛋白质的二硫键，使蛋白质几乎全部呈长椭圆棒状，其短轴约为1.8nm ，长轴与蛋白质的分子量成正比。,十二烷基磺酸钠SDS,因此，各种 SDS 蛋白质复合物在

30、电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长（即分子量）的函数。此时，在 SDS-PAGE 中蛋白质的分子量与电泳迁移率间的关系符合下列公式： lgMr = lgKbm = K1 bm 式中 Mr 为蛋白质的相对分子量， K 、K1为常数， b 为斜率， m 为迁移率。测定某种蛋白质的分子量，需要将同时电泳分离的一组标准品蛋白质的相对分子量的对数对其迁移率在半对数坐标纸上作图（横坐标为迁移率，纵坐标为标准蛋白质分子量的对数：得到标准工作曲线。将待测蛋白质的迁移率与标准品比较，就可以在标准曲线上求得其相对分子量 。,分析计算：绘制标准曲线： 按下式计算相对迁移率： 以每个蛋白标准的

31、分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。,四、凝胶过虑层析测定蛋白质相对分子量 凝胶过虑层析法主要是按照蛋白质分子大小和形状分离不同的蛋白质，因此可以分子量标准品为参照，测定样品蛋白质的Mr。,蛋白质分子在凝胶过滤柱层析中的行为以洗脱体积（ elution volume , ve ）计量。 将标准品的洗脱体积对相应分子量作图获得的标准曲线可以用来求出待测样品的分子量。Ve 与分子量的关系可以表示为： Ve = K1一K2 logMr 式中 K1 和K2为常数， Mr 为相对分子量， Ve 为洗

32、脱体积。 在用凝胶过滤柱层析法测定分子量时，首先要选择适宜的凝胶过滤基质，最常用的是葡聚糖凝胶（ Sephadex ）。,五、 激光解吸电离飞行时间质谱（laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry ，LDI-TOF-MS ） 高度纯化的蛋白质样品与有机酸混合，在靶金属表面干燥. 激光发出的射线使蛋白质离子化。这些离子经过加速后，飞入自由漂移区，最后到达检测器。 飞行时间与分子量成反比，与电量成正比。 可测定10 -15 2 10 5 MW 的蛋白质，误差仅为0.0001。,蛋白质的等电点是各种蛋白质的重要特性之一。测

33、定蛋白质的等电点对于了解该种蛋白质的理化性质和对于设计纯化该蛋白的策略均会有重要帮助。最初，人们利用变性蛋白质在等电点处易出现结絮，受热易发生凝固的特点来测定某种蛋白质的等电点。这种测定方法的准确性和精确度都很低，不能满足蛋白质结构与功能研究的需要。,第四节 等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点,1966年，瑞典科学家Rible和 Vesterberg 建立了等电聚焦（ isoelctric focusing , IEF ）技术。目前等电聚焦电泳（ isoelectric focusing electrophoresis ）已经成为单向电泳中分辨率最高的蛋白质分离技术，也成为蛋白质等电点测定的主要技

34、术。,一、等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理 蛋白质的最主要特点是它的兼性带电行为，它们在不同的pH环境中带有不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点 ( isoelectric point , pl ）。 等电聚焦电泳主要以聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶为支持物，在凝胶中加入载体两性电解质。载体两性电解质是脂肪族多氨基和多羧基类混合物，可以在电场中自然形成正极为酸性、负极为碱性的连续线性pH梯度。蛋白质分子在这一连续线性pH梯度电场中电泳时，在大于其等电点的 pH 环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的 pH 环境中以阳离子形

35、式向负极移动，最后在其等电点的相应位置聚集，由此可以测定出某种蛋白质的等电点。,二、染色及等电点分析（一）染色 电泳结束后，将胶取出，用 10三氯乙酸固定 10min后，再浸泡于1三氯乙酸中至少2h，以除去胶中的载体两性电解质，然后浸没在 0.25考马斯亮蓝 R-250 溶液中，染色 0.5-1h （最好连续轻微摇动使染色均匀）。取出凝胶，用水漂洗几次，然后加入脱色液，更换数次直至显现清晰的蛋白质区带。,（二）分析 待测蛋白质等电点的确定有三种方法。1.利用已知等电点的标准蛋白质的等电点为纵坐标，距正极 的距离为横坐标作图得标准曲线，然后在此标准曲线上根 据待测样品的位置求出它的等电点。2.用

36、微电极直接测定胶表面的 pH 而得知样品的等电点。3.将胶条切成等距离(5cm)的小块儿，浸泡于水中，用精 密试纸测定 pH 。以凝胶块距正极的距离为横坐标， pH 为纵坐标作图得出胶的 pH 梯度曲线。根据待测样品在 胶中的位置可以从图中得出其等电点值。,胰蛋白酶抑制剂pH3.5,乳球蛋白pH5.20,人碳酸酐酶pH6.55,肌红蛋白碱性带pH7.35,凝集素酸性带8.15,碱性带pH8.45,中性带pH8.65,溶菌酶pH4.55,七、蛋白质纯度的鉴定（一）层析性质的考查：每过一次柱比活力不变（二）电泳法：显示一条带（三）免疫化学法：含杂质的样品有抗原性，可通过动物免疫检查抗体，是否是一种或一种以上，若一种，说明均一。（四）蛋白质化学结构分析法（五）色谱法：只有一个洗脱峰,