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1、,第十五章 蛋白质组与新药开发第一节 简介第二节 药物分子靶标的高通量筛选体系一、基因芯片二、蛋白质芯片第三节 药物的高通量筛选体系一、高通量筛选二、计算机虚拟筛选第四节 药物作用的监测评价体系一、临床前安全性评价二、临床试验三、生物技术药物的开发,第十五章 蛋白质组与新药开发第一节 简介目前世界上存在的已知疾病大约有4500种，其中只有不到二分之一的疾病有相应的治疗手段，可以有药物对应的疾病甚至不到四分之一一个新药从开发到上市，历经十几年的时间，研究开发经费可达十几亿美元。可是，一旦上市以后，它所带来的利润也是相当可观的。,可见新药的研究开发具有广阔的前景，是一个周期长、高风险、高投入、高回
2、报的产业。当代创新药物研究竞争十分剧烈，其中竞争的焦点就在于筛选新药，问题的核心是低成本、高效率地筛选出新药，以达到缩短新药发现过程的目标。,在医药工业，发现一个新药后，临床前药理、毒理学研究平均需要3.5年。临床试验平均需要6年。审批上市平均需要2.5年。三者相加平均12年。企图从这几个发展阶段上缩短周期，加快新药上市的速度是很困难的。这几个阶段的周期长短，不但受新药研究规律所制约，也受药品审批管理法规要求的限制。,针对上述难题，新药研制机构，特别是各国的制药企业公司纷纷加大人力、财力的投入力度，将热情和注意力倾注在新药发现过程上，大量使用现代新技术，寻找切实可行的解决方案，以期抢占制药行业
3、的先机。,这就在很大程度上促进了相关科技的高速发展。基因组学组合化学高通量筛选(highthroughput screening，HTS)三种技术的联合应用使得新药研制的成本得到大幅度下降。加速了具有特定靶标的新化合物的发现。人类基因组测序工作的完成，也将为药物的寻找提供更多的可供筛选的靶标。,在欧美一些国家，将HGP的研究和新药开发结合在一起，创立了一门新的学科，叫药物基因组学(pharmacogenomics)。它以基因组学为基础，以研究开发新药为目的。在基因水平上对疾病敏感度、药物反应和副作用进行分析和研究。是药理学当中的一个新分支。,药物基因组学含义：药物效应的基因型预测和基因组学在医
4、药工业上的应用，在分子水平上证明和阐述药物疗效，药物作用的靶标、作用模式和毒副作用。,核酸作为药物作用的靶标实际上存在着致命的缺陷：(1)首先由于核酸结构的同源性联系到许多人类正常的功能，作用于DNA的药物大多选择性差，而且毒性较大，特别是形成共价结合的药物都有严重的细胞毒作用。(2)其次大多数疾病都是表征在蛋白质水平上，而不是在基因水平上。细胞和组织中mRNA的丰度与蛋白质的丰度相关性不显著(仅为0.5)；,(3)第三，将核酸结合的药物释放到相应的组织是一大难题。(4)第四，很多疾病如癌症和心血管疾病往往是多基因共同作用的结果。因此很难找到关键基因作为作用的靶标以上几点都是制约新药开发进程的
5、瓶颈。,为了阐明生命活动的本质，真正与功能研究结合，基因组的研究必然要回归到蛋白质组研究。蛋白质的结构、分布和功能：对于预测某些疾病的进程、药物作用及其过程。对于阐明不同个体之间遗传学上的差异是非常重要的。,疾病的发生与发展、药物的作用大多是在蛋白质水平上进行的。蛋白质组学研究克服了蛋白质表达和基因之间的非线性关系。将蛋白质组应用于新药研究，可以通过对疾病与正常细胞中的蛋白质组进行比较，发现可以成为药物筛选的作用靶标的、与一些疾病相关的蛋白质。而新药及其靶标的发现和药物作用的模式研究是药物蛋白质组学的重要研究内容。,为了尽快发掘到具有可成为疾病标志物或药物作用靶标的蛋白质，蛋白质组学技术向高通
6、量(大规模)和自动化方向发展。评价蛋白质组学技术发展的标准：高灵敏度高准确度高重现性,蛋白质组学可以提供一种发现和鉴定在疾病作用下表达异常的蛋白质的方法。这种蛋白质可以作为药物筛选的作用靶点。通过对疾病发生的不同阶段蛋白质的变化进行分析，发现一些疾病不同时期的蛋白标志物。这样不仅对药物发现具有指导意义，还可形成未来诊断学、治疗学的基础理论。癌症被称为当今人类的一大天敌，因而抗肿瘤药的开发也就成了科学家们研究的重点。,现今大多数抗癌药都伴有严重的毒副作用，特别是对晚期癌症病人进行单一化疗或联合放疗、过热疗法时，经常伴随着癌细胞对细胞抑制剂耐药性的发生。如果能发现在耐药细胞系中表达异常的蛋白质或者
7、与细胞毒性密切相关的蛋白质，就可以此蛋白为靶点设计用于联合用药的新化学单位(new chemical entities)。也可以此信息为参考，设计避免产生耐药性或毒副作用的药物。,造成癌症病人死亡率极高的主要原因是肿瘤的转移现在国内一些实验室已开始利用蛋白质组学技术，通过对高低转移细胞株蛋白质的比较，来寻找与肿瘤转移相关的蛋白质。同样也可以高转移株中特异表达的蛋白质为靶点，开发抑制肿瘤转移的新药。,在抗生素方面，由于传染病仍是死亡的主要原因，因而抗感染药是近年来各国新药开发的热点之一。面对抗生素耐药问题以及不断出现新的微生物的感染性疾病，老的方法显得束手无策。其根本原因就在于对药物的作用机制缺
8、乏透彻的认识。,蛋白质组学技术可以让人们清楚地了解：细菌内哪些蛋白质会在抗生素的作用下发生改变，以及发生何种变化。根据这些变化，并以蛋白质作为新药设计的靶点，筛选出新一类的抗生素。同时还可选取一些耐药菌株，考察其耐药机制,第二节 药物分子靶标的高通量筛选体系思考题：1 什么叫基因芯片？2 生物芯片技术组成部分有哪些？3 什么叫蛋白质芯片？,第二节 药物分子靶标的高通量筛选体系在药物研发中，疾病靶标有两个含义：靶基因靶蛋白靶基因的概念：通常，我们首先需要了解影响某一疾病的基因(整个代谢途径上的基因)，其中一个或一系列基因就称为靶基因。靶蛋白的概念：靶基因确定之后，就有可能针对与此疾病相关的某一个
9、基因产物蛋白质设计药物，这种蛋白质就确定为靶蛋白。,目前，已有许多新技术新方法可加快这一阶段的研究：生物信息学(bioinformatics)体外或体内表达技术(in vivo or in vitro express)超高通量(ultra high throughput)仪器微阵列技术(microarrays)反义技术(anti-sense)蛋白质组学(proteomics)技术等等这些技术是药物早期开发成功的关键。,由于许多疾病与信号传导途径异常有关，因而信号分子可以作为治疗药物设计的靶点。在信号传递过程中涉及成百上千个蛋白质，蛋白质-蛋白质相互作用发生在细胞内信号传递的所有阶段。这种复杂的
10、蛋白质作用的串联效应可以完全不受基因调节而自发地产生。通过与正常细胞作比较，掌握与疾病细胞中某个信号途径活性增加或丧失有关的蛋白质的改变，将为药物设计提供更为合理的靶点。,生物芯片(biochip)技术是近几年才发展起来的一种高通量、微型化和自动化检测技术，又称微阵列(microarray)分析技术。它应用于生命科学的许多领域：疾病相关基因的发现疾病分子诊断预测及基因功能研究等(见图)。,在药物领域:对于药物靶标的发现多靶位同步超高通量药物筛选药物作用的分子机理中医药基础理论现代化药物活性及毒性评价等方面都有其他方法无可比拟的优越性。,生物芯片技术至少由5部分组成：具有特殊表面的芯片本身。在芯
11、片上点布或原位合成核酸(或蛋白质)探针得到微阵列的设备。布阵的质量直接影响微阵列分析的结果目前喷泡(bubble jet)技术和寡核苷酸的无屏蔽原位(maskless in situ)合成技术的建立使微阵列分析技术得到很大提高。,用于与靶DNA杂交的流体系统。读取芯片的扫描仪。定量分析和解释结果的完善的软件程序。另外还需要从生物材料中提取核酸以备分析的工具。基因芯片(genechip)及蛋白质芯片(proteinchip)均属于生物芯片，都是近年来发展起来的新的生物技术。现在它们越来越多地应用到生物学、医学、遗传学、药理学和毒理学等多个方面，并开始崭露头角。,一、基因芯片及其应用基因芯片概念：
12、基因芯片又称DNA或cDNA微阵列(DNA or cDNA microarray)，是指在面积很小的载体上，点布数以万计不同的寡核苷酸或cDNA，将芯片与标记有荧光染料的待测DNA或mRNA杂交，,与靶序列配合好的探针会产生强烈的杂交信号如果有碱基的错配，信号就会减弱。籍此能判断靶DNA或mRNA中与芯片相应基因的突变或表达等情况。,它的特点是：一次性检测样本量大成本相对低计算机自动分析结果以及快速、准确等。因此适于靶DNA或mRNA的高通量筛选。,在肿瘤研究和诊治方面，Wang等将5766种cDNA点布在一张基因芯片上，用它检测正常卵巢组织和卵巢肿瘤之间各基因表达的差异。鉴定了在卵巢癌变过程
13、中起着重要作用的几种基因，这也为肿瘤的诊断和治疗带来了新的方法和途径。另外还有多种癌症组织被人们用这种方法所研究，这些肿瘤基因表达谱的研究对于肿瘤的分类和提供癌症的新型基因靶标提供了可能。,近年来，随着分子生物学的不断发展，越来越多的单基因遗传病的基因被克隆出来。利用基因芯片检测容量大的特点，可根据某个遗传病的特定基因，设计一组包含能检测该基因各外显子上所有可能出现突变的DNA序列位点的寡核苷酸探针，制成一张芯片。,利用杂交时会出现碱基错配杂交信号减弱的特性，经计算机分析扫描信号，将该基因上的杂合性突变检测出来，并分析出该突变位点在突变后有无mRNA表达、表达后翻译的蛋白质功能变化的可能情况。
14、使得一次检测就可以完成对一系列疾病的基因诊断。,单张芯片上容纳的寡核苷酸探针越多一次检测能够诊断的基因遗传病种类也越多。随着基因芯片产量的增加，价格也会逐步下降，使得对基因遗传病的诊断和产前诊断在实际中的应用成为现实。,二、蛋白质芯片蛋白质芯片又称蛋白质微阵列(protein microarray)蛋白质芯片是继基因芯片之后，作为基因芯片功能的补充发展起来的。DNA基因芯片为描绘不同组织的mRNA表达谱提供了可能，并且得到了广泛的应用。一个基因在转录时也许以多种mRNA形式剪接,而同一种蛋白质可能会以多种形式进行翻译后修饰，蛋白质组中蛋白质的数量可能超过基因组的数量。所以更能反映生物体机能的是
15、蛋白质表达谱，而不是mRNA表达谱。蛋白质芯片的发展使得在同一时相分析整个蛋白质组成为可能。,蛋白质芯片的两种常用的分离手段：（1）保留色谱（2）预活化芯片表面用于蛋白质芯片表面的色谱主要有：反相色谱离子色谱(阴离子和阳离子)交换色谱金属亲和色谱等,预活化表面主要是基于蛋白质之间的专一性作用。如：抗原一抗体结合和受体一配基等。通过分离，可以将从细胞或体液中分离出的具有某些共同特性的蛋白质富集至蛋白质芯片上用于进一步的分析。,蛋白质芯片的概念：与基因芯片相似，蛋白质芯片就是在载体上点布高密度不同种类的蛋白质，然后再用标记了荧光染料的已知抗体或配体等与待测样本中的抗体或配体一起同芯片上的蛋白质竞争
16、结合，在扫描仪上读出荧光强弱，利用计算机分析计算出待测样本结果。在此基础上进一步发展到对各种蛋白质、抗体以及配体的检测，弥补了基因芯片检测的空缺。,从而在SELDI-TOF-MS中获得比普通MALDI-TOF-MS信号更强(灵敏度更高)、更均一、重复性更好的谱图，进行蛋白质的相对分子质量和相对定量分析。与DNA芯片一样，蛋白质芯片同样蕴涵着丰富的信息量，必须利用专门的计算机软件包进行图像分析、结果定量和解释，才能应用于疾病靶标蛋白质的发现与筛选研究。,目前我国在生物芯片研发及生产技术、应用等方面已经取得了很大的成功。世界首例用于肿瘤早期检测的多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统，日前已在上海数康生物科
17、技有限公司开发研制问世，经多家医院临床试验和备方专家论证鉴定，国家药品监督管理局已正式为其颁发了生物制品一类新药证书及试生产批文。,这一系统是基于生物芯片技术和免疫学技术通过检测12种肿瘤标志物可以达到对10种常见肿瘤:原发性肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结直肠癌、乳腺癌进行同时检测的目的，可广泛地应用于临床辅助诊断、体检普查等领域。,第三节 药物的高通量筛选体系一、高通量筛选二、计算机虚拟筛选,第三节 药物的高通量筛选体系综合运用蛋白质组技术等筛选得到疾病靶标蛋白质以后，可以合理设计针对疾病靶标特点的先导化合物及其活性类似物。要想得到临床药物，还需要对其进行
18、大规模活性筛选。,在人类基因组计划进行的近几年中，药物筛选有了很大发展，现代药物筛选包括以下几个层次：计算机模拟药物筛选和计算机辅助设计。运用计算机技术，以药物靶标分子三维结构和蛋白质晶体结构为基础，对含有大量化合物结构的数据库进行模拟“筛选，迅速高效地发现先导化合物及其新用途。,分子水平的药物筛选模型。利用生命活动中发挥重要作用的基因位点、受体、酶、离子通道、核酸等生物大分子作为药物筛选的作用靶点进行分子水平筛选，其中，基因芯片和蛋白质芯片将被广泛应用。,细胞水平的药物筛选模型。利用离体培养细胞株、转基因细胞株进行药物作用的筛选或鉴定。动物个体水平的药物筛选模型。动物试验作为药物在人体临床前
19、的鉴定模型，转基因和基因剔除动物模型的平台建立，为药物筛选和基因治疗提供了实验模型。人体临床筛选模型。作为药物上市前的最后筛选。,采用分子水平的筛选模型已被普遍用于模拟药物筛选的第一步初筛，其优点:特异性强、灵敏度高、微量快速。蛋白质组学技术应用于筛选模型构建中的一个最大的优势:更清楚、更详尽地阐明分子药理机制，提供更为有效、合理的药理模型。,现在蛋白质组学的研究结果表明:蛋白质基因表达的调控成了真正的药物作用机制。在药物发现阶段，大量合成的有机化合物和分离得到的天然产物有效成分，在有效的药理模型上利用自动化的筛选技术对其进行随机筛选，发现具有进一步开发价值的化合物，称为先导化合物(1ead
20、compound)。药物发现阶段对创新药物的研究具有决定性的意义，筛选效率的提高将大大缩短新药发现的周期。蛋白质组学技术除能够促进靶点的发现外，还有助于筛选模型的建立。,在新药研究中形成了药物发现过程的新方法，出现了高通量筛选(high throughput screening,HTS)体系:高通量筛选：有机地将组合化学、基因组研究、生物信息和自动化仪器、机器人等先进技术进行组合，形成一种发现新药的新程序。高通量筛选是药物产业化过程中的一个关键环节，它是测试标靶相对于批量化合物的结合能力或生物学活性。,被测试化合物可能作为:标靶的抑制物天然受体结合位点的竞争物细胞内受体介导过程的激活物或拮抗物
21、等。制药公司一般一次要筛选100 000300 000个以上的化合物，从中确定100300个候选物.最后，1-2个化合物可能成为先导化合物。,在HTS(高通量筛选)发展之前的90年代初期，采用传统的方法:一个实验室借助20余种药物作用靶位，一年内可以筛选75 000个样品；到了1997年HTS发展的初期，采用100余种靶位，每年可筛选1 000 000个样品；到1999年，由于HTS的进一步完善，每天的筛选量就高达100 000种化合物。因此称为超高通量筛选(ultrahighthroughput screening)这种新的飞跃，将大大加速新药发现的速度。,HTS系统应用和推广的关键在于必须
22、具备相应的新药筛选模型。近年来以基因表达产物为模型建立的新药筛选模型为HTS的应用提供了有利条件。如根据人类重要疾病的种类，以每种疾病可能涉及的基因及每种基因产物在致病过程中可能与之相关的蛋白相互作用数目计算，预计基因组研究的结果可提供500010 000种分子药靶，靶位数目将超过以往的20余倍。,二、计算机虚拟筛选 计算机虚拟筛选(in silico screening / virtual screening)：主要用于限定(减少)提交生物学筛选的化合物数量和结构特征。它是综合计算机辅助药物分子设计等多学科的一种筛选优筛(focused screening)策略。（1）它覆盖了计算机辅助药物
23、分子设计的大部分研究领域，从组合化学库的合理设计到三维结构化学关系数据库的自动产生；,（2）从库中分子结构相似性分类到化合物是否具备药物类似性的快速预测；（3）从对系列化合物三维定量构效关系研究与药效团的构建，到药物分子与受体相互作用的精确计算机模拟。其目的是在大量化合物样品库中挑选出能代表分子多样性和药物类似性的分子，作为候选先导化合物进行生物学筛选，从而大大减少药物开发的消耗和缩短药物开发的周期。,第四节 药物作用的监测评价体系经过大规模筛选后的先导化合物进入药物开发阶段。这一阶段包括：药效学研究药代动力学研究安全性评价和临床试验等步骤。,这一过程最大的特点：耗时又耗资，且常常是幸存者寥寥
24、无几。尤其是在临床试验中被淘汰出局的为多数。分析其原因:缺乏对药物的毒理机制深入了解缺乏有效的临床前安全性评价指标。蛋白质组学的出现及时有效地弥补了这块空白。,一、临床前安全性评价人们越来越认识到蛋白质组学在药物毒理机制研究中的重要性。蛋白质组数据库能根据蛋白质点的强度反映一种疾病的过程变化或对一组药物反应的变化。蛋白质可以用作药物反应或疾病的替代标志。环孢素A造成严重的肾毒性原因的探明是蛋白质组学在药物毒理机制研究中成功应用的一个很好的例子。,环孢素A是一种应用广泛的免疫抑制剂被成功地用于器官移植手术中和自身免疫疾病的治疗中但应用中也伴随着许多副作用，其中最值得注意的是肾毒性。用环孢素A处治
25、后最明显的结果是:部分蛋白点消失，这些蛋白点后来从大鼠肾脏蛋白质模式中被鉴定为calbindin-D的28 kDa蛋白。使用酶联免疫吸收剂分析的进一步研究证实，大鼠肾脏中calbindin-D的28 kDa蛋白量持续减少。,这种减少伴随着尿钙排泄物和皮层脊髓管内石灰化的增加。如果calbindin-D 28 kDa蛋白扮演钙运输的促进器和钙缓冲器的角色，观察到的效应就能得到解释。 环孢素A毒性标志物的鉴定，为其毒效提供了可靠的说明.这是蛋白质组与其他的技术结合的成功应用结果。,第二个生物标记蛋白质成功鉴别的例子来自膀胱鳞片状细胞癌进程的长期研究在此研究中，可以监测定义蛋白质标志物和癌损害的分化
26、程度。Aicher等这样评论蛋白质组：“鉴于目前蛋白质组相关技术已取得的长足进步，人们有信心期待大规模蛋白质组学将成为进行临床安全性评价的重要工具。,二、临床试验利用蛋白质组学可以检测到疾病相关蛋白质，这些蛋白质实际上就是指示疾病发生的分子标志物。这些分子信号将来有可能被用作在临床试验中监测受试者用药反应的参考。同时也可以这些分子信号为依据进行最适临床受试者的挑选。,三、生物技术药物的开发生物技术药物包括：基因工程重组蛋白质药物寡核苷酸药物基因工程抗体药物DNA药物等生物技术药物发展的主要动力：来源是基因组和蛋白质组的研究。其中最令人注目的进展是抗体药物。,抗体是机体抵抗病原体的主要防御系统。
27、它们是由免疫系统自主产生的蛋白质。每个抗体都可特异性地识别作为抗原靶分子的特征，哪怕是极其微小的差别。目前，大多数抗体药物都是鼠人嵌合体抗体或人源化抗体。由于传统的产生抗体方法是基于鼠的免疫机制，来源是鼠类，因而临床易发生免疫排斥反应。针对这一问题，CAT生物技术公司正在利用蛋白质组学独特的技术体系，以及组合噬菌体抗体文库(combinatorial phage antibody librarys)，加上后基因组学的一些技术，开发能够成为今后人类治疗药物的人源抗体。,随着后基因组时代的到来和科学技术尤其是蛋白组学、生物信息学等的发展。蛋白组学在药物开发中的作用会越来越明显通过蛋白质组学开发出的药物也会逐渐深入到人们的生活中去。,
