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1、第八章 离体授粉,花药 Anther花丝 Filament,子房 Ovary花柱 Style柱头 Stigma,8.1.1 进行离体授粉的目的,克服受精前障碍。,8.1 离体授粉的方法,造成受精障碍的因素：,花粉在柱头上不能萌发；,花粉管不能进人胚珠，造成这种现象的原因或是由于花柱太长，或是由于花粉管生长速度太慢，还没长到花柱基部子房已经脱落；,花粉管在花柱中破裂。,克服受精前障碍的方法：蕾期授粉，截断花柱，对花柱进行热处理，辐照处理，混合花粉授粉等。,8.1.2 离体授粉的含义,离体胚珠授粉： 将花粉授于离体的胚珠上，进而实现受精作用的方法,子房授粉：将花粉粒直接送入子房以实现受精作用的方法
2、。,离体授粉:把通过在培养的整个雌蕊的柱头上授粉而结实的方法称为离体授粉。离体授粉包括：,离体胎座授粉：把花粉授于连在胎座的胚珠上 ，进而实现受精作用的方法,离体柱头授粉：把花粉授于离体子房的柱头上，进而实现受精作用的方法,试管受精：离体的卵细胞和自由游动的精子在体外的融合。,离体授粉的应用： 克服自交不亲和 克服杂交不亲和 通过孤雌生殖产生单倍体,8.1.3 离体授粉的方法,子房授粉的方法 ：,由开裂的花药中采集花粉，将之悬浮于含有100 mg/L硼酸的无菌重蒸馏水中，密度为每滴悬浮液100-300个花粉粒。,在开花之前2d，将用做母本的花去雄套袋。,开花以后，将子房用酒精棉进行表面消毒。,
3、在子房两侧彼此相对的位置上钻2个小孔，用注射器由1个小孔向子房内注入花粉悬浮液，子房内的空气则由另1个小孔排出。悬浮液要注满子房腔，直到开始由另一小孔中流出为止。,注射完毕以后，将2个小孔用凡士林封闭。,也可通过一个小缝送人花粉，这可能比通过小孔注人花粉悬浮液的效果更好。 注意：在去雄时只摘除雄蕊，若把花萼和花冠同时去掉则会使子房枯萎。,离体授粉的方法：,确定开花、花药开裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精作用的时间；,去雄后将花蕾套袋隔离；,为了避免意外授粉，用做母本的花蕾必须在开花之前去雄并套上纸袋。,采集花粉粒。,为了在无菌条件下采集花粉，把尚未开裂的花药从花蕾中夹出，置于无菌培养皿中直到花药
4、开裂。若要从已开放的花中摘取花药，须将花药进行表面消毒，然后把它们置于无菌培养皿中已灭过菌的滤纸上，直到开裂。,柱头、胎座或胚珠的处理,无菌条件下剥取胚珠,开花之后12d，将花蕾取下，拿入实验室准备进行无菌培养。将花萼和花瓣去掉，把雌蕊在70酒精中漂洗数秒，以适当的杀菌剂进行表面消毒，最后用无菌蒸馏水彻底洗净，去掉柱头和花柱，剥去子房壁，使胚珠暴露出来。,在进行离体柱头授粉的时候，须对雌蕊进行仔细的表面消毒，但不要使消毒液触及柱头。,接种,一般就是将这个长着胚珠的整个胎座连同一小段花柄用于胎座授粉，或是把胎座切成两半或数块，每块带有若干胚珠，然后以各自的切口和培养基接触，进行培养。,单个胚珠接
5、种在培养基,把整个子房接种在培养基,授粉,将散出的花粉在无菌条件下按实验要求授于培养的胚珠、胎座或柱头上。据报道，把花粉授在胚珠或胎座上的效果，比撒在胚珠周围的培养基上效果好。,离体授粉方法成败的最重要标志，是在受精之后能否由胚珠（在胚珠和胎座授粉中）或子房（在柱头授粉中）形成有生活力的种子。,枣离体授粉及胚珠培养初探,郝慧，李登科，金竹萍等,材料和方法,试验材料取自山西省农业科学院果树研究所国家枣种质资源圃采用前期试验筛选出的壶瓶枣和晋矮1号两个性状优良的品种分别作为父母本,采集尚未开花的花蕾，将其剪成适合操作的小段(尽量保留零级花)，经常规方法消毒以后用无菌水漂洗3次用镊子剥去花萼和花冠，
6、取壶瓶枣花粉作父本，晋矮一号去雄作母本，离体子房和花药经活化后进行人工授粉并接种于培养基上，于(251)光照条件下培养培养30 d后解剖、观察，将成活胚珠取出并转接至胚珠培养基上部分子房作连续继代培养,不同培养基上子房生长及胚珠成活情况,接种的子房在2 d3 d后膨大，颜色由绿转黄，但各培养基上的子房生长情况又有所不同变化最为明显的是5号和7号培养基中的材料，体积膨大明显优于其它培养基，且颜色更为鲜亮。,不同培养基中子房的成活率也有差异，其中在7号培养基中最高，为88.9% ，5号培养基次之，为84.9%。,继代培养的子房保持生长约90 d以后不再膨大。,接种30 d后解剖成活并膨大的子房，这
7、时胚珠大多已褐化、枯死，仅有少量存活成活胚珠为白色，大而透明，其中，有少数为子房二室三胚珠，未见三个胚珠同时存活情形,子房愈伤组织化与胚珠成活情况：,接种以后部分子房愈伤组织化从剥离出的成活胚珠的比例来看，绝大多数成活胚珠来自愈伤组织化的子房(表3)。,胚珠离体培养：将剥出的离体胚珠接种于固体或液体胚珠培养基中胚珠存活一段时间以后褐化死亡,具体做法是，将柱头、花柱和子房壁组织全部去掉，使胚珠裸露，将花粉粒直接撒于胚珠之上，然后把胚珠置于人工培养基上培养，直到种子成熟。落到胚珠表面上的花粉粒1015 min后萌发，授粉后12d内完成受精，5d内受精胚珠膨大，鼓胀而不透明，里面已形成了一个4个细胞
8、的原胚和若干胚乳游离核。22 d后，具有两片子叶的胚即已分化完全。,罂粟的离体胚珠授粉,8.2 胚珠和子房培养,8.2.1 胚珠培养,胚珠培养是植物组织培养的一个重要方面，该项技术最初尝试于20世纪30年代，并在兰科植物获得成功， 20世纪5O年代以后不断得以完善并取得重要突破。在观赏园艺、蔬菜以及果树等方面均有人进行这方面的研究工作，迄今已在葡萄、桃、李、洋葱、番茄、多花水仙等多种园艺植物上取得成功。,利用胚珠离体培养可以克服远缘杂交育种中的胚早期败育障碍， 以及胚珠试管受精克服远缘杂交不亲合性。,黄瓜受精胚珠离体培养的研究,供试黄瓜品种为津杂二号，87-3，87-6，87-9。人工授粉后分
9、别取4-16日龄的子房为外植体， 用自来水冲洗干净， 分别用7O 乙醇消毒3O秒，0.1HgCl2灭菌1O分钟，最后无菌水冲洗四次。,将子房切成内含胚珠的薄片， 接种于预培养基上(MS+蔗糖10% +琼脂0.8% )。约15天左右外植体表面发白， 胚珠凸起， 取出胚珠移到12MS+蔗糖2 +琼脂0.8% 的诱导培养基上。培养2O天即生成胚珠试管苗 ， 然后转移到生根壮苗培养基上(MS+蔗糖3%+琼脂0.8% )。,一般经过20天左右胚珠苗就可生成为具有正常根、茎、叶的健壮小植株。,生长健壮的试管苗经过2天炼苗后分别采用普通移栽法、试管外生根移栽法和T8培养基生根移栽法进行移栽， 观察成活率。,
10、培养室温度25-27 。预培养和诱导培养阶段每日光照1 6小时，生根壮苗阶段每日12小时， 光照强度均为3000lx。,Maheshwari 等曾由罂粟授粉后6d的离体胚珠中，获得了有生活力的种子，培养时在这些胚珠中含有的只是合子或2个细胞的原胚及少数胚乳核。,在一种只含有Nitsch (1951）培养基的无机盐，White (1943）培养基的维生素、5蔗糖，而没有任何生长调节物质的相当简单的培养基上，这些胚的生长速度起初虽比在活体条件下慢，但长到球形期以后，生长非常迅速。授粉后26 d，这些在培养的胚珠中的胚已长到0. 93 mm，而同期在活体中的胚最大长度也只有0. 65 mm。,在葱莲
11、属植物中，情况与罂粟属植物和兰花不同，当把含有一个合子和初生胚乳核的胚珠置于Nitsch培养基上培养时，胚虽能长到球形期，但不能分化。即使在培养基中添加了生长调节物质，如激动素、IAA或GA3，也不能促进胚的进一步生长。然而，若在培养基中加入椰子汁或水解酪蛋白，胚即能正常发育，种子能在原位萌发。组氨酸、精氨酸和亮氨酸能完全取代水解酪蛋白的这种促进作用。,在培养基中添加激动素或水解酪蛋白能加速这些胚在初期阶段的生长。,在白车轴草（Trifolium repens）中，只有在培养基中添加了黄瓜或西瓜幼果（开花后10 d）的果汁时，授粉12 d后处在合子期或双细胞原胚期的胚珠，在培养中才能发育成成熟
12、种子。若加人黄瓜汁后再加GA3(10 mg/L)，则能进一步促进这些非常幼嫩的胚珠发育成种子。,在离体胚株的发育中，培养基的滲透压起着重要的作用，特别是对非常幼嫩的胚珠，其作用格外重要。在矮牵牛中，授粉后7d的胚株处于胚期，若把它们剥离下来，置于含有蔗糖的培养基上培养（蔗糖浓度在410%的范围内高低皆可），它们即能发育为成熟种子。若胚珠内含有的是合子和少数胚乳核，最适的蔗糖浓度为6；若紧在受精之后，则为8。,培养基的滲透压,Pontovich和Sveshnikova(1966)观察到，在罂粟离体胚珠（含有合子或双细胞原胚）培养中，即使培养基里补加了水解酪蛋白、椰子汁、腺嘌呤或激动素，胚仍不能进
13、行分化。然而，若是培养连在胎座上的胚珠，合子就能发育成一个正常分化的胚。这就是在离体培养中胎座组织对胚珠生长和发育的有益影响。,胎座具有类似的促进种子发育的作用,有些杂种胚在发育早期即可能夭折，要想在此之前把它们剥离下来进行培养，或很麻烦或不可能。在这种情况下，胚珠培养对于获得杂种就有很大的潜在价值。,在树棉（Gossypium arboreum）陆地棉（G.hirsutuin）杂交中，杂种胚只能发育到授粉后810 d为止，以后则出现大量的异常现象，使胚不能进一步发育。Beasley (1940)和Weaver(1958)把它们的未成熟胚进行培养，以期获得完整的植株，但离体胚没能生长。Pund
14、ir(1967)在授粉后3 d(胚珠内含有合子或三细胞原胚)，把胚珠剥离下来，放在含有50 mg/L肌醇的MS培养基上培养，5周后胚已充分分化，7周后7080的胚珠长成了杂种幼苗。,20世纪50年代末，植物胚胎学家开始了未授粉胚珠培养的探索，试图闯出离体诱导单倍体的新途径，然而未能成功。20世纪60年代，Tulecke(1 964)离体培养未授粉的银杏雌配子体，得到单倍体愈伤组织，但没有分化成植株。在被子植物中Nishi和Mit Suoka(1 969)对水稻未授粉子房培养产生了二倍体和四倍体植株，但未获得单倍体。20世纪7080年代， Uchimiya等(1971)从未传粉的玉米子房和茄子的
15、胚珠诱导出愈伤组织，并观察到其中有单倍体细胞的分裂，表明雌配子体人工诱导单倍体植株是可能的。,Jenson等进行未授粉棉花胚珠培养诱导了极核融合和分裂，但没有进一步的结果。san Noeum (1 976)首次利用大麦(Hordeum vulgare)为授粉子房培养出单倍体植株。随后国内用未授粉的小麦及烟草子房培育出单倍体植株(祝仲纯和吴海观1979)，以后的报道逐渐增多。经统计目前共对20科40余种种子植物未授粉子房或胚珠进行过离体培养，成功培养出单倍体植株的植物已达10个科、25个种及2变种。,研究较多地集中在禾本科、茄科、百合科、葫芦科及菊科，占全部再生植株物种的23，尤以禾本科的研究最
16、多，占全部种的l4多。在水稻(周嫦等，1983；Li et a1，1998)和非洲菊中已分别建立起可重复的培养流程。,该项研究成功的意义在于开辟了单倍体育种的另一途径，这对于花粉培养尚未获得成功和雄性不育的物种尤为重要。并且为实验生殖细胞学，特别是雌核发育的研究建立了良好体系。同时为开展植物的遗传工程提供了新的受体(蔡得田和陈冬玲，1986)。,未受精子房和胚珠培养的技术因物种不同而有所差异，但包括以下基本技术程序：（1）选择合适的基因型材料（2）确定合适的接种时期（胚囊单核期至接近成熟时期的材料）（3）确定合适的培养基（4）采用合适的接种方式（5）保温培养（6）染色体鉴定（7）染色体加倍（8
17、）胚囊植株及其后代观察,8.2.2子房培养,Nitsch (1951)在一种合成培养基上培养了小黄瓜、草毒、番茄、烟草和菜豆等的离体子房，从而奠定了子房培养技术。由已授过粉的花中剥离下来的小黄瓜和番茄的子房发育成了成熟的果实，里面着生着有生活力的种子。然而，这些果实比自然形成的小。同样，在离体条件下发育的摩洛哥柳穿鱼（Linaria macroccana）和旱金莲(Tropaeolum majus)的果实，也不能达到在自然条件下所能达到的大小。,Maheshwari和Lal(1958,1961)在屈曲花（Iberis amara）中成功地培养了授粉后1d的离体子房。这个时期的子房含有一个合子和
18、少数几个胚乳游离核。在一种含有无机盐和蔗糖的简单培养基上，这些子房生长情况良好，只是胚仍比自然形成的小。当在培养基中添加了B族维生素以后，则获得了正常大小的果实，它们的样子可与在自然条件下长成的果实相媲美。若在这种无机盐-蔗糖-维生素培养基中再加人IAA，在离体条件下形成的果实甚至能比在活体条件下形成的果实更大一些。,在莳萝和天仙子中，合子期或双细胞原胚期的子房在培养中也能正常发育。在补加了椰子汁的培养基上，莳萝子房长成的果实能超过天然果实的大小。,离体培养的研究表明，花被的功能不是仅仅充做性器官的保护结构，在果实和胚胎的发育中它也起着重要的作用。,在培养普通小麦和斯卑尔脱小麦授粉后不久的子房
19、时，只有小花的花被（内外稃）完整无缺，胚才能正常发育。若把花被去掉，原胚的生长就要受到损害。,在大麦中La Croix等（1962）也发现了类似的结果，并由此断定“花被因子”是胚的正常发育多必需的。当不存在这些“花被因子”时，大麦胚的细胞虽能伸长并合成DNA，但不能分裂。,在双子叶植物中，去掉花萼也会导致果实发育不良。因此，当在离体条件下进行柱头授粉的时候，保留花冠是十分重要的。,在两个有性不亲合物种油菜和甘蓝的种间杂交中，Inomata (1979 )利用子房培养的方法成功地获得了杂种。,8.3.1基因型,8.3离体授粉中影响结实的因子,在多种植物培养中，不同基因型在培养中的反应不同。非洲菊
20、(Gerbera jamsonii)切花型品种间愈伤组织的诱导频率有很大差异，“Fresultane”为8、Super Gerbera”12.5、“K9-8”43.3；盆栽型17个基因型中有4个不能诱导愈伤组织，7个的诱导率高于3.,8.3.2外植体,在腋花矮牵牛（Petunia axillaris）中，离体授粉的胚珠，无论是剥离下来的单个胚珠，还是连在一块胎座上的一组胚珠，都不能形成有生活力的种子。这是因为花粉粒虽能正常萌发，但花粉管不能进人胚珠。然而，当所有胚珠都原封不动地连在完整的胎座上时，授粉后由花粉萌发直到长出有生活力的种子的整个过程一切正常。,据Wagne：和Hess(1973)报
21、道，在矮牵牛中，若是把花柱全部去掉，在胎座授粉之后，对结实将会产生有害的影响。因而，在进行离体授粉的时候，他们培养的是整个雌蕊，为了使胚珠暴露出来，只是剥去子房外壁。,在玉米中，连在穗轴组织上的子房比单个子房离体授粉效果好。减少每个外植体上的子房数目虽然并不影响受精，但对籽粒的发育会产生有害的影响。只带有12个子房的小块穗轴不能形成任何发育充分的籽粒。4个子房一组时，只能形成不大的籽粒;10个子房一组时，其中有12个能充分发育，长成大籽粒。,在进行柱头授粉的时候，应当避免弄湿胚珠和柱头的表面，否则将会影响花粉萌发，导致花粉管破裂，造成结实不良。,由雌蕊上剥离胚珠的时间对于离体授粉后的结实率有明
22、显影响。在开花后12d剥离的胚珠比在开花当天剥离的胚珠结实率较高。玉米果穗进行离体授粉的适期是在抽丝后34 d 。,在剥离胚珠或雌蕊时，雌蕊的生理状态对离体授粉后的结实率也有影响。Balatkova等（1977)看到，在烟草中，由曾用本身花粉或苹果属植物花粉授过粉的雌蕊上剥离下来的未受精胚珠，比由未授过粉的雌蕊上剥离下来的胚珠，经烟草花粉离体授粉后的结实率高。已知花粉在柱头上萌发和花粉管穿越花柱都会影响子房内的代谢活动。Deurenberg(1976)等证实，花粉管和花柱之间的互作，能够刺激子房中蛋白质的合成。Balatkova等（1977)在烟草中证实了这项观察。,这些结果表明，在实验植物的
23、栽培条件下，如果对授粉、花粉管生长、花粉管进入子房和双受精等先后发生的时间有详细的了解，就有可能把剥离胚珠的时间选择在雌蕊授粉之后和花粉管进入子房之前，这样就会增加离体授粉成功的机会。在这点上，腋花矮牵牛是个令人感兴趣的物种，由于它具有自交不亲合性，当在同一个雌蕊上同时用本身的花粉进行柱头授粉和胎座授粉时，由后者所导致的受精过程和种子发育都不受前者的干扰。,8.3.3培养基,离体授粉方法涉及到两个主要过程：花粉粒的萌发和花粉管的生长，结果导致受精；受精的胚珠发育为成熟的种子，里面有一个有生活力的胚。这项技术的效率在很大程度上取决于能够促成这两个过程的培养基的成分。,要想实现花粉萌发和花粉管生长
24、并不困难。而且在胎座授粉（这在各种类型的离体授粉方法中是最有前途的一种）中，当花粉粒撒落在胚珠上以后，若能在胚珠表面萌发，花粉管随即长入胚珠，与培养基并无接触。若花粉粒不能在胚珠表面萌发，就需要在一种适当的培养基上单独培养花粉粒，然后把花粉管置于胚珠表面。据Raman等（1980)报道，在玉米中，用已萌发的花粉进行离体授粉之后，可以形成种子。,十字花科植物的三细胞成熟花粉不易在离体条件下萌发，因而对这种植物难于进行离体授粉。 为了在甘蓝中得到有萌发力的种子，Kameya等（1966）对于离体授粉方法做了一些改变。,他们先把离体胚珠在1 % CaCl2溶液中蘸一下以后，再把它们放在一张载玻片上（
25、这张载玻片事先已涂敷了一层厚约40 m的10明胶溶液），然后立即用由刚开放的花中采集到的花粉进行授粉。把载玻片放在培养皿中，用一个里面贴有一片湿滤纸的盖子盖上，保存24 h之后，把已受精的胚珠转到Nitsch琼脂培养基上，未受精的胚珠淘汰。通过这个方法，Kameya等由原来75个授过粉的胚珠中，获得了2个具有萌发力的种子。若不用CaCl2处理则不能形成种子，可见 Ca2+具有刺激花粉萌发和花粉管生长的作用。,培养基最重要的作用在于促进受精胚珠的正常发育。因此，一项经验之谈是，在进行离体授粉试验之前，先要对准备用做母本植物的幼龄胚珠（含有合子或几个细胞的原胚）在培养中所需的最适营养成分和激素组成
26、有所了解。这些知识有助于增加成功几率。,确实，在虞美人离体胎座授粉的研究中，Kanta等(1962）所以能最先获得了有生活力的种子，成功的秘诀就在这里。他们使用的培养基与Maheshwari和Lal(1961)所用的完全相同，但后两位作者培养成功的是在活体条件下已授粉6d的虞美人胚珠，培养时那些胚珠已经受精。,通常用于离体授粉培养基中的无机盐类，与Nitsch(1951)在进行子房培养时所用的无机盐类相同，此外再加上蔗糖和维生素（White, 1943)。Sladky和Havel (1976）曾试验过几种不同的基本培养基，包括White (1943), MS (1962）以及Nitsch(19
27、69）培养基等，但没有发现离体授粉子房对它们的反应有什么显著的差异。,培养基中蔗糖的浓度几乎都是45。在玉米中，虽然有些作者使用过浓度高达15 %17的蔗糖，但Dhaliwal和King(1978)在正常的5蔗糖水平上，也由种内和种间离体授粉获得了有生活力的种子。据Bajaj (1979)报道，7的蔗糖对玉米最合适。,关于各种生长调节物质和其他补加物对胚珠培养中种子发育的效果，资料十分贫乏。这可能就是不能形成种子的原因，尤其是当在离体条件下花粉萌发、花粉管长人胚珠和受精作用都能正常进行时，不能形成种子的原因。 一般的做法是在基本培养基中补加500 mg/l水解酪蛋白（CH)。不过，Rangas
28、wamy和 Shivanna (1971)在腋花矮牵牛以自身花粉进行胎座授粉之后，并未发现CH对种子发育有任何有利的影响。,Balatkova等（1977）研究了IAA、激动素、番茄汁(TJ)、椰子汁(CM)和酵母浸出液（YE）等对烟草胎座授粉后种子发育的效果，发现CM, TJ和YE有抑制作用，而若加人10 g/L IAA或0.1 g/L激动素，则能显著提高每个子房的结实数。较高水平的激动素（(1 g/L）也有抑制作用。,据Sladky和Havel(1976)报道，在离体授粉的玉米子房培养中，鸡蛋黄（每升100滴）对花粉萌发和种子发育具有有利的作用，不过，以后的作者没有加人这种复杂的混合物也能
29、使离体授粉的玉米子房形成种子。,8.3.4培养条件,培养温度一般保持在25-28，有的植物需较高或较低的温度，如洋葱20-22 ，而棉花未受精胚珠在312培养也能很好诱导未受精胚珠的离体发育。有的植物则需要采取不同的昼夜培养温度如；洋葱白天27，夜间24可很好诱导未受精胚珠的离体发育。,Balatkova等（1977）指出，在某些实验中温度可以影响结实率。他们在水仙属植物中发现，若把培养物保存在15 ，而不是通常的25，能显著增加每个子房的结实数。然而，在罂粟中，由于它是在较温暖的条件下开花的植物，低温培养并不能提高结实率。,培养期间的光照条件也有较大影响。马铃薯(Solaum tuberosum) 子房诱导培养需在散射光或黑暗条件下进行；分化阶段则用日光灯每日照射8h(约2 000 Ix)。百合在800-1200lx下诱导培养，分化培养在2000-3000 lx下。洋葱胚的诱导采用白天光照16h，光强2000 lx，随后的植株诱导则需1500 lx光强；但也可一直采用光照16 h /d ，光强4000 lx。,关于光对离体授粉胚珠的影响几乎没有什么资料。在一般情况下，培养物都是保存在黑暗中或近乎黑暗中。Zenkteler(1969,1980)发现，无论培养物是在光照下培养还是在黑暗中培养，离体授粉的结果没有任何差别。,
